Genomische und evolutionäre Analyse von MHC-Klasse-I-Genen bei einem Halbaffen (Microcebus murinus)

Neff, Jennifer

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Genomische und evolutionäre Analyse von MHC-Klasse-I-Genen bei einem Halbaffen (Microcebus murinus)

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Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Säuger spielt beim Zustandekommen der Immunantwort eine entscheidene Rolle. Die Klasse-I-, bzw. Klasse-II-Moleküle präsentieren die von verschiedenen Erregern abstammenden Peptide an die T-Lymphozyten, die daraufhin eine Immunreaktion auslösen. Der MHC ist mit vielen immunologischen Krankheiten, wie z.B. Infektions- und Autoimmunerkrankungen assoziiert. Weiterhin determiniert der MHC die Histokompatibilität bei Transplantationen. Für die Erforschung dieser Krankheiten unter Nutzung von Tiermodellen ist daher die genomische Kenntnis des jeweiligen MHC unerlässlich. Bereits die komplette Sequenzierung des HLA-Systems des Menschen und des RT1-Systems der Ratte sowie viele Teilsequenzen des MHC weiterer Säuger bieten die Möglichkeit, Vergleiche und evolutionäre Beziehungen untereinander herzustellen. Primaten dienen häufig als Modelle für die Erforschung MHC-assoziierter Erkrankungen, jedoch ist bisher sehr wenig über deren genetische Vielfalt bekannt. Die strukturelle Analyse der MHC-Klasse-I-Gene sowie deren Evolution waren das Ziel dieser Arbeit. Unter Nutzung einer genomischen BAC-Bank eines Grauen Mausmakis sollten die MHC-Klasse-I-Gene sowie eventuell vorhandene MIC-Gene identifiziert und physikalisch kartiert werden. Weiterhin war es für die Erstellung der physikalischen Karte der MHC-Region notwendig die Framework-Gene zu bestimmen und mit den Framework-Genen vom Menschen, der Maus, der Ratte und des Rhesusaffen zu vergleichen. Ein zusätzlicher Aspekt war die Analyse der evolutionären Beziehung der MHC-Klasse-I-Gene zu anderen Halbaffen und zu höheren Primaten. Aus der BAC-Bank eines Microcebus murinus (CHORI-257) wurden insgesamt 73 MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone identifiziert. Die Analyse der etablierten Contigs wies drei MHC-Klasse-I-Gencluster auf, die in die Intervalle BAT1-TCF19 (Contig 1), CAT56-TRIM26 (Contig 2) und PPP1R11-MOG (Contig 3) eingeteilt wurden. Ein zusätzliches Intervall, das MHC-Klasse-I-Gene sowie das Gen TRIM26 enthalten, konnte im Contig 4 zusammengefaßt werden, so daß eine vorläufige Genkarte erstellt wurde. Für das Contig 1 konnten fünf MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone identifiziert werden, die alle ein MHC-Klasse-I-Fragment sowie ein MIC-Fragment besitzen. Für das Contig 2 wurden zwölf MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone identifiziert, die alle ein MHC-Klasse-I-Gen besitzen, aber keine MIC-Gene tragen. Das Contig 3 enthält vier BAC-Klone, von denen zwei BAC-Klone jeweils zwei MHC-Klasse-I-Gene sowie Framework-Gene aufweisen. Die anderen beiden BAC-Klone besitzen dagegen nur Framework-Gene aus dieser MHC-Region. Für das Contig 4 wurden neun MHC-Klasse-I-positive BAC-Klone identifiziert, die jeweils fünf bis sieben MHC-Klasse-I-Gene sowie ausschließlich das Framework-Gen TRIM26 besitzen. Bei der Analyse der MHC-Region zeigte sich, dass die MHC-Klasse-I-Gene des Microcebus von den gleichen Framework-Genen wie beim Rhesusaffen, beim Menschen, bei den Nagern und weiteren Säugetieren flankiert werden. Es wird daher angenommen, dass die genomische Architektur der MHC-Klasse-I-Region der Halbaffen identisch mit der aus bereits bekannten Spezies ist. Für das Contig 1 war es anhand der Sequenzierung des BAC-Klons 487C11 möglich, eine präzise Genkarte zu erstellen. Die vergleichende Analyse der Sequenz des NFKBIL1-STG-Intervalls von Microcebus murinus und vom Menschen zeigt mit Ausnahme der MHC-Klasse-I-Gene, ein hohes Maß an Konserviertheit. Die MHC-Klasse-I-Gene sowie die MIC-Gene besitzen einen ausgeprägten Polymorphismus, der sich auch beim Microcebus murinus darstellt. Interessanterweise beinhaltet das NFKBIL1-STG-Intervall nur ein Klasse-I-Gen und ein MIC-Gen, die sich als Pseudogene herausstellten. Mit Hilfe der Erstellung eines phylogenetischen Stammbaums konnten ausschließlich paraloge Beziehungen zwischen den MHC-Klasse-I-Genen des Menschen und des Microcebus murinus nachgewiesen werden. Die physikalische Kartierung des MHC von Microcebus murinus soll neue genomische Grundlagendaten liefern, die weitere Analysen der MHC-Region für Krankheitssuszeptibilität, Immunreaktivität und Transplantationsabstossung sowie die Evolution des MHC ermöglichen. Zusätzlich bietet die Karte die Grundlage für anschließende Sequenzierungen der BAC-Klone der einzelnen Contigs.

The major histocompatibility complex (MHC) plays a central role in the control of the immune response. The class I and class II molecules present pathogen-derived peptides on their cell surface to cytotoxic T cells and T helper cells, respectively, thereby initiating the adaptive immune response. The MHC is associated with many immunological diseases, e.g. infectious and autoimmune diseases. Furthermore, the MHC determines histocompatibility in organ transplantation. For the study of such diseases, animal models play an important role. Therefore, the genomic knowledge of the respective MHC is mandatory. The complete sequences of the MHC of human and the rat as well as many partial sequences of the MHC of further mammals offers the opportunity of comparative and evolutionary analyses. Primates are frequently used as models for the study of MHC-associated diseases, but less is known about their genetic diversity. The aims of the study were the structural and evolutionary analysis of the MHC class I genes in Microcebus murinus. By screening a commercially available BAC-library, class I genes and MIC genes should be identified and physically mapped. Furthermore the framework genes should be identified and compared with those in human, mouse and rat. Altogether 73 BAC clones could be identified. Analysis of the established BAC clonal contigs indicated the presence of three class I gene clusters that map into the BAT1 and TCF19, CAT56 and TRIM26, PPP1R11 and MOG intervals, respectively. An additional class I gene and TRIM26 gene containing cluster in a fourth contig could also be identified. Cluster 1 includes five MHC class I positive BAC clones, which all have one MHC class I gene and one MIC gene. Twelve MHC class I positive BAC clones with one MHC class I gene but no MIC genes could be arranged in cluster 2. Cluster 3 includes four MHC class I positive BAC clones. Two clones have two MHC class I genes and framework genes of this region, whereas the two other clones only have framework genes. Nine MHC class I positive clones belong to the additional TRIM26 cluster, which have five to seven MHC class I genes and only the framework gene TRIM26. The grey mouse lemur class I gene clusters are flanked by the same “framework” genes (non class I / non class II) as in human, mouse, and rat MHC, indicating a similar genetic architecture. For Contig 1 a precise gene map could be established based on the complete sequence of BAC clone 487C11. The comparative analysis of the sequence of the NFKBIL1-STG interval in Microcebus murinus and human shows a high degree of conservation, with the exeption of MHC class I genes. The MHC class I genes as well as the MIC genes of Microcebus murinus are polymorphic. Interestingly the NFKBIL1-STG interval harbors only a single class I gene and a single MIC gene, which are both pseudogenes. Phylogenetic tree analysis indicates solely paralogous relationships between the MHC class I genes of Microcebus murinus and human. Physical mapping of the MHC class I region of Microcebus murinus provides the basis for further studying MHC disease associations, immune reactivity and graft rejection as well as MHC evolution. Additionally, the map is the basis for the complete sequencing of the MHC region.