Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Auswirkungen einer singulären, oralen Endotoxinapplikation auf die Intestinalmukosa des Karpfen (Cyprinus carpio) unter besonderer Berücksichtigung der sezernierten Muzine

Neuhaus, Henner

The intestinal mucus layer of carps forms a biofilm which protects the epithelium and is able to bind a variety of harmful agents. The present study was aimed to define the reaction of the intestinal mucosa to a single peroral application of endotoxin (LPS; lipopolysaccharide from E. coli O55:B5) with special consideration to its secreted mucins. The used LPS is a component of the cellwall of gram-negative bacteria. For the study, sixty sibling carp were used. Firstly, the untreated (normal) status of the mucins were assesed histologically; secondly, the same was done after a single application of endodoxin. Both, general carbohydrate- and specific lectin-histochemical methods were applied. Gut samples for histology were taken at days one, two, three, five and eight after application of LPS. Histologically no obvious changes of mucus structure could be found. Therefore, a biochemical analysis of mucin properties was conduced with an examination of carbohydrate-and the protein-contents by means of PAS and Bradford specification. Mucins were seperated from the gut at days one, two, three, five and eight after application of endotoxin with isolation mediums. Epithelial (intracellular) and luminal (extracellular) mucins were measured separately. Furthermore, the terminal glycolisation pattern of the separated mucins was detected by lectin-binding (lectin-ELISA). After endotoxin application, the qualitiy and quantity of the intestinal mucus had changed. Initially, the goblet cells secreted one part of their specific mucus at day one after application. Histologically, the cell shape changed from thick and round to small and thin. Biochemically, a statistically significant decrease of fully developed, epithelial mucins could be demonstrated. An day two, the total amount of luminal mucus decreased to about fifty percent of the amount of the untreated carp. Simultanously, an increase of epithelial mucins with a small molecular weight was found. Obviously, a new biosynthesis of mucins started at day one after the endotoxin stimulus and reached its peak at day three and five after application. At the same time, a modification of the pattern of mucin glycolisation of the mucins was visible. Fucose as a specific monosaccharide of mammalian mucins could only be detected at day two and three after application. This indicates that fucose plays a different, but important role in the mucosal mechanisms of the immune defense. Neuraminic-acid, a-galactose and b-galactose as equally typical monosaccharides of mucins increased at day one, two and three after application in the epithelial mucins. In conclusion, intestinal fish mucus seems to contain the same monosaccharides as intestinal mucus of mammalian and the related biosynthesis itself seems to proceed in the same way. The study showed that a singule peroral application of endotoxin is able to change important biochemical features of the mucus layer of the carp. This modulation could remove the harmful agents by a massive secretion of mucins. Therefore, the noxe may bind to the high amounts of mucus and could be discharged from the gut. It can be assumed that by loss of mucins the intestinal epithelium becomes vulnerable to further potential noxes.

Die Mukusschicht im Darm des Karpfen übernimmt die Rolle eines Biofilms, welcher das Epithel schützt sowie verschiedene Noxen binden kann. Im Rahmen der Arbeit wurde die Reaktion der intestinalen Mukusschicht auf eine singuläre, perorale Endotoxinapplikation untersucht. Als Endotoxin fand das in der Zellwand von gram-negativen Bakterien befindliche Lipopolysaccharid (LPS; von E. coli O55:B5) Anwendung. Für den Versuch kamen Karpfen derselben genetischen Linie und desselben Alters zum Einsatz. Dabei wurde zunächst der unbehandelte und daraufhin der stimulierte Zustand nach oraler Endotoxin-Applikation an den Versuchstagen eins, zwei, drei, fünf und acht des intestinalen Gewebes samt seiner Muzine histologisch erfasst. Zur Anwendung gelangten Kohlenhydrat-Histochemische Nachweise einschließlich Lektinfärbungen. Die Histologie und Histochemie ließen nur geringe Veränderungen erkennen, weshalb eine biochemische Muzinanalyse mittels Separation des Mukus durch Isolationsmedien durchgeführt wurde. Dabei erfolgte eine getrennte Betrachtung epithelialer sowie luminaler Muzine, wobei zunächst der Gesamt-Kohlenhydrat-Gehalt mittels PAS (Per-Iod-Schiff-)-Reaktion und der Gesamt-Protein-Anteil mittels Bradford-Reaktion bestimmt wurde. Daraufhin erfolgte die Erfassung der terminalen Glykosilierung der separierten Muzine an den genannten Versuchstagen mit Hilfe eines Lektin-bindenden Nachweis-Verfahrens (Lektin-ELISA). Nach der LPS-Applikation ergaben sich kleine histologische und histochemische Veränderungen. Am Tag eins p. appl. kam es zunächst zu einer histologisch und biochemisch erfaßbaren Entleerung der Becherzellen. Es zeigte sich, dass die luminale Gesamt-Mukusmenge in der Folge am Tag zwei und drei p. appl. deutlich abnahm und gleichzeitig eine Zunahme der epithelialen Muzinfraktionen - vor allem der Muzine mit kleinerer Molekülmasse - auftrat. Dieser Hinweis auf eine Neusynthese von Muzinen setzte bereits an Versuchstag eins ein und erreichte an den Versuchstagen drei und fünf den Höhepunkt. Gleichzeitig war eine Änderung im terminalen Glykosilierungsmuster der epithelialen und luminalen Muzine zu erkennen. So erfolgten die deutlichsten Veränderungen im epithelialen Mukus an den Versuchstagen zwei und drei sowie im luminalen Mukus vor allem an den Versuchstagen eins, zwei und drei. Diese Verschiebungen sind vermutlich durch die gesteigerte Muzinsynthese, durch eine Ausschleusung noch nicht komplett glykosilierter Mukus-Moleküle sowie durch eine gerichtete Beseitigung der Noxe durch Chemotaxis mit anschließender Adhäsion an den intestinalen Mukus bedingt. Möglicherweise übernimmt der Mukus eine Art Köderfunktion. Gleichzeitig konnte eine Veränderung im Glykosilierungsmuster der Muzine bestimmt werden. Fukose als ein typisches Monosaccharid des Säuger-Mukus konnte bei der eigenen Untersuchung nur an den Versuchstagen zwei und drei bestimmt werden. Fukose scheint somit im Vergleich zum Säuger eine unterschiedliche, aber entscheidende Rolle bei der mukosalen Immunabwehr zu spielen. Sialinsäure sowie a- und b-Galaktose als weitere Monosaccharide in Muzinen nahmen in ihrem Gehalt an den Versuchstagen eins, zwei und drei zu. Als Schlussfolgerung enthält der Mukus des Karpfen dieselben Monosaccharide wie im Säuger, wobei die Biosynthese der Muzine analog zu der des Säugers abzulaufen scheint. Die Daten dieser Studie zeigen, dass eine singuläre, orale Endotoxin-Applikation quantitative sowie qualitative Auswirkungen auf die Intestinalmukosa des Karpfen samt ihrer sezernierten Muzine hat und deren Funktion modulieren kann. Dabei scheint die Beseitigung der Noxe durch einen abspülenden Effekt massiv sezernierter Muzine im Vordergrund zu stehen. Neben dem abspülenden Effekt wird eine eintretende verstärkte Adhäsion der bakteriellen Noxe an den Mukus die Ausschleusung unterstützen. Es ist zu vermuten, dass durch den Verlust an Muzinen das Darmepithel für eine zweite, potentielle Noxe ungeschützter ist.

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Neuhaus, Henner: Auswirkungen einer singulären, oralen Endotoxinapplikation auf die Intestinalmukosa des Karpfen (Cyprinus carpio) unter besonderer Berücksichtigung der sezernierten Muzine. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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