Experimentelle Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf im Rahmen des kommerziellen Embryonentransfers beim Rind

Ziel dieser Arbeit war es festzustellen, ob die partielle Zonadissektion bei frisch übertragenen oder wieder aufgetauten kryokonservierten Rinderembryonen den Transfererfolg (hier: Anzahl lebend geborener Kälber) im kommerziellen Embryonentransfer (ET) steigern kann. Weiterhin sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen morphometrischen Parametern des Embryos, insbesondere der Dicke der Zona pellucida, und dem ET-Erfolg beim Rind analysiert werden. Im Versuchszeitraum vom September 2001 bis zum Juli 2002 wurden insgesamt 711 vollständig auswertbare Embryonentransfers bei zwei kommerziellen Arbeitsgruppen (ET-Team Soest: n = 108; ET-Team Marsberg: n = 603) durchgeführt. 672 Embryonen stammten von 165 mit eCG superovulierten Spendertieren (128 Kühe und 37 Rinder), 39 Embryonen von 10 Spenderkühen waren Importe. Die Empfängertiere (450 Kühe und 208 Rinder) zeigten entweder eine natürliche Brunst (n = 187) oder wurden mittels einer (n = 463) oder zwei Cloprostenolgaben im Abstand von 10 Tagen (n = 8) zyklussynchronisiert. Die Embryonen der unterschiedlichen Donoren, Embryoqualitätsgruppen und -entwicklungsstadien wurden direkt nach der Gewinnung (n = 281) oder nach dem Auftauen (n = 362) zufällig der Versuchsgruppe (V) oder der Kontrollgruppe (K) zugeteilt. In der Versuchsgruppe (n = 349 Embryonen) erfolgte ein Transfer nach partieller Zonadissektion (Öffnung der Zona pellucida über 120 µm), während die Embryonen der Kontrollgruppe (n = 334) mit intakter Zona pellucida übertragen wurden. Insgesamt 330 Embryonen konnten vor der Mikromanipulation bzw. dem Transfer fotografisch erfasst und unter zu Hilfenahme des Programms ImageJ (Sun Microsystems Inc. N.I.H., USA) vermessen werden.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:   1.                 Embryotransfer – Gesamtergebnisse   Nach den Transfers wurden 327 Kälber lebend geboren (2 eineiige Zwillingspaare aus der Kontrollgruppe wurden hierbei jeweils als nur 1 Nachkomme gezählt). In 331 Fällen blieb die Gravidität aus, bei 31 Rezipienten wurde die Trächtigkeit nicht erfolgreich beendet (Aborte: n = 26, 3,7 %; verstorbene trächtige Empfängertiere: n = 5, 0,7 %), und 22 Kälber (3,1 %) waren peripartal gestorben (1 eineiiges Zwillingspaar aus der Kontrollgruppe wurde hier ebenfalls als nur 1 Nachkomme gewertet). Bei der weiteren Auswertung der Ergebnisse wurden die Aborte, die toten graviden Kühe und die toten Kälber nicht berücksichtigt, da für den kommerziellen ET die lebend geborenen Kälber relevant sind.   2.                 Ergebnisse des assistierten Zonaschlupfes (AH):   Nach AH gebaren insgesamt 177/324 Tiere (54,6 %) ein lebendes Kalb, während in der gesamten Kontrollgruppe 150/334 (44,9 %) lebende Nachkommen zur Welt kamen (P < 0.05).   Werden die Embryonen unterschiedlicher Qualitätsklassen (sehr gut: n = 405, gut: n = 211 und mäßig: n = 42) miteinander verglichen, ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den sehr guten Versuchs- und Kontrollembryonen (V 114/189, 60,3 % vs. K 101/216, 46,8 %, P < 0,05).   Bei den kryokonservierten Embryonen mit AH nach dem Auftauen wurden insgesamt nach Transfer signifikant mehr lebende Kälber geboren als nach der Übertragung tiefgefrorener und wieder aufgetauter Kontrollembryonen (V 110/191, 57,6 % vs. K 79/186, 42,5 %, P < 0,05). Auch hier waren nach Transfer sehr guter Embryonen der Versuchsgruppe signifikant bessere Ergebnisse (P < 0,05) zu verzeichnen, als mit den sehr guten Embryonen der Kontrollgruppe (V 87/144, 60,4 % vs. K 58/136; 42,7 %).   Differenziert man die Anzahl der lebenden Nachkommen im Hinblick auf die unterschiedlichen embryonalen Entwicklungsstadien, die zum Transfer kamen (insgesamt 373 kompakte Morulae, 185 frühe Blastozysten und 100 Blastozysten), werden signifikante Unterschiede bei den aufgetauten frühen Blastozysten (V 45/70, 64,3 % vs. K 27/60, 45,0 %, P < 0,05) und bei den Blastozysten sehr guter Qualität (V 23/31, 74,2 %, vs. 21/48, 43,8 %, P < 0,05) der Versuchs- und ihrer jeweiligen Kontrollgruppe registriert.   3.                 Auswertung weiterer Einflussfaktoren auf den ET   In der Untersuchung wurden die von den beiden ET-Teams erzielten Transferergebnisse miteinander verglichen. Der Prozentsatz an lebend geborenen Kälbern unterschied sich deutlich, jedoch nicht signifikant (Soest, 45/100, 45,0 % vs. Marsberg, 282/558, 50,5 %).   Jahreszeitliche Einflüsse auf den Transfererfolg (Vergleich von 3 Zeitperioden: 10. Sept. – 12. Dez. 2001, 103/190, 54,2 %; 20. Dez. – 28. März 2002, 133/293, 45,4 %; 5. April – 4. Juli 2002, 91/175, 52,0 %) wurden nach Übertragung von kryokonservierten Embryonen beobachtet (September bis Dezember: 70/125, 56,0 % vs. Dezember bis März: 68/159, 42,8 %, P < 0,05).   Bei der Analyse des Einflusses der Herkunft der Embryonen (249/491, 50,7 % Embryonen von Kühen vs. 78/167, 46,7 % Embryonen von nulliparen Rindern) fiel auf, dass mehr lebende Kälber aus dem Transfer von Embryonen resultierten, die von Kühen gewonnen worden waren. Diese Unterschiede waren bei Embryonen guter Qualität hoch signifikant (Kuhembryonen: 80/149, 53,7 % vs. Rinderembryonen: 17/62, 27,4 %, P < 0,001). Wurde die Rasse der Spendertiere dem Vergleich zugrunde gelegt (224/453, 49,5 % Schwarzbunte; 56/116, 48,3 % Rotbunte; 28/49, 57,1 % Fleckvieh) zeigten sich bessere, jedoch statistisch nicht signifikante Resultate bei Fleckvieh-Embryonen.   Der Vergleich von Kühen und nulliparen Rindern als Embryonenempfänger zeigte, dass insgesamt mehr lebende Kälber von Rindern als von Kühen geboren wurden (Rinder: 238/450, 52,9 %, vs. Kühe 89/208, 42,8 %, P < 0,05). Dies wurde auch bei den Embryonen guter Qualität deutlich (Rinder: 75/145, 51,7 % vs. Kühe: 22/66, 33,3 %, P < 0,05). Die Nutzung von Fleckviehempfängertieren (38/66, 57,6 %) führte zu besseren Transferergebnissen als die Verwendung Deutscher Schwarzbunter (221/450, 49,1 %) und Deutscher Rotbunter (55/115, 47,8 %). Signifikante Unterschiede wurden jedoch nur zwischen Fleckvieh und Deutschen Schwarzbunten nach Transfer sehr guter Embryonen festgestellt (28/42, 66,7 %, vs. 143/289, 49,5 %, P < 0,05). Tiere, bei denen eine Zyklussynchronisation mittels einer einmaligen Cloprostenolgabe (218/463; 47,1 %) durchgeführt wurde, eigneten sich, wenn auch nicht signifikant, schlechter als Rezipienten, als spontan brünstige Tiere (101/187; 54,0 %).   4.         Morphometrische Analyse der Embryonen   Bei kompakten Morulae (n =167) konnte durchschnittlich eine Zonadicke von 12,839 µm + 1,102 µm, ein Zonadurchmesser von 166,049 µm + 6,359 µm und ein Durchmesser des eigentlichen Embryos ohne Zona von 101,850 µm + 7,687 µm ermittelt werden. Diese Werte betrugen bei frühen Blastozysten (n = 107) jeweils 12,622 µm + 1,161 µm, 165,899 µm + 9,609 µm und 106,828 µm + 12,418 µm und bei Blastozysten (n = 46) 12,360 µm + 1,359 µm, 167,248 µm + 9,538 µm und 114,336 µm + 18,872 µm. Das Kalbeergebnis wurde von diesen Parametern nicht beeinflusst, jedoch fielen signifikante Unterschiede bei dem Vergleich der Entwicklungsstadien auf (P < 0,05).   Abschließend bleibt festzuhalten, dass ein assistierter Zonaschlupf beim Rind den Transfererfolg signifikant steigern kann. Ein besonders deutlicher Vorteil ergeben sich für die Embryonen sehr guter Qualität und für die aufgetaut transferierten Embryonen. Die Methode ist leicht und erfolgreich in kommerzielle Embryotransferprogramme zu integrieren.