Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf im Rahmen des kommerziellen Embryonentransfers beim Rind

Rüther, Michael

The aim of this study was to prove whether the success rate (number of living calves) in commercial embryo transfer (ET) could be improved by partial zona dissection in fresh or frozen-thawed bovine embryos. Furthermore, a possible relationship between morphometrical parameters of embryos, especially the thickness of zona pellucida, and the ET success was analysed. A total of 711 embryo transfers were carried out by two commercially working ET-teams (Soest: n = 108; Marsberg: n 603) between September 2001 and July 2002. In total 672 embryos originated from 165 donors (128 cows and 37 heifers) following superovulation with eCG, while 39 embryos were imports. The recipients (450 cows and 208 heifers) were either synchronised with cloprostenol (single injection, n = 463 or twice Injection, n = 8) or naturally cycling (n = 187). Embryos from different donors were transferred directly after collection (n = 281) or after cryopreservation (n = 362). They were randomly assigned either to the assisted hatching group (AH) or to the control group (C). In the experimental group, 349 embryos were transferred after partial zona dissection over a length of about 120 µm, while in group C (n = 334) the zona pellucida remained intact. Altogether, 330 embryos were photographed and measured morphometrically (ImageJ, Sun Microsystems Inc. N.I.H., USA) prior to micromanipulation.     The following results were obtained:           1.         Embryo transfer – Total results   After transfer, 327 calves were born alive (two pairs of identical twins from group C were only counted as a single calf respectively). In 331 animals no pregnancy was achieved, 31 recipients did not carry to term (abortions: n = 26, 3.7%; death of pregnant recipients: n = 5, 0.7%) and 22 calves (3.1%) died parturition (one set of twins in group C was also counted as a single ton birth). Abortions, dead pregnant cows and dead calves were not included into the final analysis as they are not relevant in commercial embryo transfer.   2.         Assisted hatching (AH)   In group AH 54.6 % (177 / 324) of the recipients gave birth to a living calf as compared to live offspring (44.9 % (150 / 334)) in the control group (P<0.05). Comparing the quality of the embryos (very good: n = 405, good: n = 211 and fair: n = 42), significant differences were found between the very good AH and very good control embryos (AH 114/189, 60.3 % vs. C 101/216, 46.8 %, P<0.05).   From all frozen/thawed embryos used for AH more life offspring were achieved after transfer than in the control group (AH 110/191, 57.6 % vs. C 79/186, 42.5 %, P≤0.05). In addition, after transfer of very good frozen/thawed embryos in the AH group significantly better results (P<0.05) were obtained than after transfer of the very good frozen/thawed embryos in the control group (AH 87/144, 60.4 % vs. C 58/136; 42.7 %). Considering the developmental stage of transferred embryos, (373 compact morulae, 185 early blastocysts and 100 blastocysts) significant differences were seen for of frozen/thawed early blastocysts (AH 45/70, 64.3 %, vs. C 27/60 45.0 %, P<0.05) and very good blastocysts (AH 23/31, 74.2 %, vs. C 21/48, 43.8 % P<0.05).         3.         Evaluation of further influences on the ET results   Transfer results between both ET-teams differed not significantly (Soest, 45/100, 45.0 % vs. Marsberg, 282/558, 50.5 %). A striking influence of the season, in which the transfer was performed, was seen (comparison of three seasons: 10. Sept. - 12. Dec. 2001, 103/190, 54.2 %; 20. Dec. - 28. March 2002, 133/293, 45.4 %; 5. April - 4. July 2002, 91/175, 52.0 %) between frozen/thawed embryos in group one (September and December: 70/125, 56.0 %) and group two (December until March: 68/159, 42.8 %, P<0.05). Embryos originating from cows resulted in more living offspring than those from heifers (249/491, 50.7 % cow embryos vs. 78/167, 46.7 % heifer embryos). These differences were especially obvious with embryos of good quality (cow embryos: 80/149, 53.7 %; heifer embryos: 17/62, 27.4 %, P< 0.001). Differences in the calving rate were seen after transfer of embryos from donors of different breeds (224/453, 49.5 % German Holstein Friesian; 56/116, 48.3 % German Red Pied; 28/49, 57.1 % German Simmental). Comparing cows with heifers as recipients, more living calves were delivered by heifers than by cows (heifer 238/450, 52.9 %, vs. cows 89/208, 42.8 %, P<0.05). After transfer of embryos to German Simmental recipients more living calves (38/66, 57.6 %) were born than after transfer to German Holstein Friesian (221/450, 49.1 %) and German Red Pied (55/115, 47.8 %), but differences were only significant between German Simmental and German Holstein Friesian recipients following transfer of very good embryos (28/42, 66.7 % vs. 143/289, 49.5 %, P<0.05). Animals with a synchronised cycle (one cloprostenol application 218/463; 47.1 % pregnancyrate) seemed to be less suitable as recipients than those in natural heat (101/187; 54.0 %), but differences were not significant.       4.         Morphometry of the embryos   The thickness of the zona pellucida in compact morulae (n = 167) was 12.839 µm ± 1.102 µm, while a zona diameter of 166.049 µm ± 6.359 µm and diameter of the embryo (without zona pellucida) of 101.850 µm ± 7.687 µm was measured. These parameters reached 12.622 µm ± 1.161 µm, 165.899 ± 1.359 µm and 106.828 µm ± 12.418 µm in the early blastocysts (n = 107) and 12.360 µm ± 1.359 µm, 167.248 ± 9.538 µm and 114.336 ± 18.872 µm in blastocysts (n = 46), respectively. Differences between the developmental stages were significant (P<0.05) Neither zona thickness nor diameter of the zona or embryo were correlated with the calving results.   It can be concluded that assisted hatching can improve embryo transfer results. The advantage was most obvious in embryos of highest quality and in frozen-thawed embryo. The method is easy and can be used successfully in commercial embryo transfer programs.

Ziel dieser Arbeit war es festzustellen, ob die partielle Zonadissektion bei frisch übertragenen oder wieder aufgetauten kryokonservierten Rinderembryonen den Transfererfolg (hier: Anzahl lebend geborener Kälber) im kommerziellen Embryonentransfer (ET) steigern kann. Weiterhin sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen morphometrischen Parametern des Embryos, insbesondere der Dicke der Zona pellucida, und dem ET-Erfolg beim Rind analysiert werden. Im Versuchszeitraum vom September 2001 bis zum Juli 2002 wurden insgesamt 711 vollständig auswertbare Embryonentransfers bei zwei kommerziellen Arbeitsgruppen (ET-Team Soest: n = 108; ET-Team Marsberg: n = 603) durchgeführt. 672 Embryonen stammten von 165 mit eCG superovulierten Spendertieren (128 Kühe und 37 Rinder), 39 Embryonen von 10 Spenderkühen waren Importe. Die Empfängertiere (450 Kühe und 208 Rinder) zeigten entweder eine natürliche Brunst (n = 187) oder wurden mittels einer (n = 463) oder zwei Cloprostenolgaben im Abstand von 10 Tagen (n = 8) zyklussynchronisiert. Die Embryonen der unterschiedlichen Donoren, Embryoqualitätsgruppen und -entwicklungsstadien wurden direkt nach der Gewinnung (n = 281) oder nach dem Auftauen (n = 362) zufällig der Versuchsgruppe (V) oder der Kontrollgruppe (K) zugeteilt. In der Versuchsgruppe (n = 349 Embryonen) erfolgte ein Transfer nach partieller Zonadissektion (Öffnung der Zona pellucida über 120 µm), während die Embryonen der Kontrollgruppe (n = 334) mit intakter Zona pellucida übertragen wurden. Insgesamt 330 Embryonen konnten vor der Mikromanipulation bzw. dem Transfer fotografisch erfasst und unter zu Hilfenahme des Programms ImageJ (Sun Microsystems Inc. N.I.H., USA) vermessen werden.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:   1.                 Embryotransfer – Gesamtergebnisse   Nach den Transfers wurden 327 Kälber lebend geboren (2 eineiige Zwillingspaare aus der Kontrollgruppe wurden hierbei jeweils als nur 1 Nachkomme gezählt). In 331 Fällen blieb die Gravidität aus, bei 31 Rezipienten wurde die Trächtigkeit nicht erfolgreich beendet (Aborte: n = 26, 3,7 %; verstorbene trächtige Empfängertiere: n = 5, 0,7 %), und 22 Kälber (3,1 %) waren peripartal gestorben (1 eineiiges Zwillingspaar aus der Kontrollgruppe wurde hier ebenfalls als nur 1 Nachkomme gewertet). Bei der weiteren Auswertung der Ergebnisse wurden die Aborte, die toten graviden Kühe und die toten Kälber nicht berücksichtigt, da für den kommerziellen ET die lebend geborenen Kälber relevant sind.   2.                 Ergebnisse des assistierten Zonaschlupfes (AH):   Nach AH gebaren insgesamt 177/324 Tiere (54,6 %) ein lebendes Kalb, während in der gesamten Kontrollgruppe 150/334 (44,9 %) lebende Nachkommen zur Welt kamen (P < 0.05).   Werden die Embryonen unterschiedlicher Qualitätsklassen (sehr gut: n = 405, gut: n = 211 und mäßig: n = 42) miteinander verglichen, ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den sehr guten Versuchs- und Kontrollembryonen (V 114/189, 60,3 % vs. K 101/216, 46,8 %, P < 0,05).   Bei den kryokonservierten Embryonen mit AH nach dem Auftauen wurden insgesamt nach Transfer signifikant mehr lebende Kälber geboren als nach der Übertragung tiefgefrorener und wieder aufgetauter Kontrollembryonen (V 110/191, 57,6 % vs. K 79/186, 42,5 %, P < 0,05). Auch hier waren nach Transfer sehr guter Embryonen der Versuchsgruppe signifikant bessere Ergebnisse (P < 0,05) zu verzeichnen, als mit den sehr guten Embryonen der Kontrollgruppe (V 87/144, 60,4 % vs. K 58/136; 42,7 %).   Differenziert man die Anzahl der lebenden Nachkommen im Hinblick auf die unterschiedlichen embryonalen Entwicklungsstadien, die zum Transfer kamen (insgesamt 373 kompakte Morulae, 185 frühe Blastozysten und 100 Blastozysten), werden signifikante Unterschiede bei den aufgetauten frühen Blastozysten (V 45/70, 64,3 % vs. K 27/60, 45,0 %, P < 0,05) und bei den Blastozysten sehr guter Qualität (V 23/31, 74,2 %, vs. 21/48, 43,8 %, P < 0,05) der Versuchs- und ihrer jeweiligen Kontrollgruppe registriert.   3.                 Auswertung weiterer Einflussfaktoren auf den ET   In der Untersuchung wurden die von den beiden ET-Teams erzielten Transferergebnisse miteinander verglichen. Der Prozentsatz an lebend geborenen Kälbern unterschied sich deutlich, jedoch nicht signifikant (Soest, 45/100, 45,0 % vs. Marsberg, 282/558, 50,5 %).   Jahreszeitliche Einflüsse auf den Transfererfolg (Vergleich von 3 Zeitperioden: 10. Sept. – 12. Dez. 2001, 103/190, 54,2 %; 20. Dez. – 28. März 2002, 133/293, 45,4 %; 5. April – 4. Juli 2002, 91/175, 52,0 %) wurden nach Übertragung von kryokonservierten Embryonen beobachtet (September bis Dezember: 70/125, 56,0 % vs. Dezember bis März: 68/159, 42,8 %, P < 0,05).   Bei der Analyse des Einflusses der Herkunft der Embryonen (249/491, 50,7 % Embryonen von Kühen vs. 78/167, 46,7 % Embryonen von nulliparen Rindern) fiel auf, dass mehr lebende Kälber aus dem Transfer von Embryonen resultierten, die von Kühen gewonnen worden waren. Diese Unterschiede waren bei Embryonen guter Qualität hoch signifikant (Kuhembryonen: 80/149, 53,7 % vs. Rinderembryonen: 17/62, 27,4 %, P < 0,001). Wurde die Rasse der Spendertiere dem Vergleich zugrunde gelegt (224/453, 49,5 % Schwarzbunte; 56/116, 48,3 % Rotbunte; 28/49, 57,1 % Fleckvieh) zeigten sich bessere, jedoch statistisch nicht signifikante Resultate bei Fleckvieh-Embryonen.   Der Vergleich von Kühen und nulliparen Rindern als Embryonenempfänger zeigte, dass insgesamt mehr lebende Kälber von Rindern als von Kühen geboren wurden (Rinder: 238/450, 52,9 %, vs. Kühe 89/208, 42,8 %, P < 0,05). Dies wurde auch bei den Embryonen guter Qualität deutlich (Rinder: 75/145, 51,7 % vs. Kühe: 22/66, 33,3 %, P < 0,05). Die Nutzung von Fleckviehempfängertieren (38/66, 57,6 %) führte zu besseren Transferergebnissen als die Verwendung Deutscher Schwarzbunter (221/450, 49,1 %) und Deutscher Rotbunter (55/115, 47,8 %). Signifikante Unterschiede wurden jedoch nur zwischen Fleckvieh und Deutschen Schwarzbunten nach Transfer sehr guter Embryonen festgestellt (28/42, 66,7 %, vs. 143/289, 49,5 %, P < 0,05). Tiere, bei denen eine Zyklussynchronisation mittels einer einmaligen Cloprostenolgabe (218/463; 47,1 %) durchgeführt wurde, eigneten sich, wenn auch nicht signifikant, schlechter als Rezipienten, als spontan brünstige Tiere (101/187; 54,0 %).   4.         Morphometrische Analyse der Embryonen   Bei kompakten Morulae (n =167) konnte durchschnittlich eine Zonadicke von 12,839 µm + 1,102 µm, ein Zonadurchmesser von 166,049 µm + 6,359 µm und ein Durchmesser des eigentlichen Embryos ohne Zona von 101,850 µm + 7,687 µm ermittelt werden. Diese Werte betrugen bei frühen Blastozysten (n = 107) jeweils 12,622 µm + 1,161 µm, 165,899 µm + 9,609 µm und 106,828 µm + 12,418 µm und bei Blastozysten (n = 46) 12,360 µm + 1,359 µm, 167,248 µm + 9,538 µm und 114,336 µm + 18,872 µm. Das Kalbeergebnis wurde von diesen Parametern nicht beeinflusst, jedoch fielen signifikante Unterschiede bei dem Vergleich der Entwicklungsstadien auf (P < 0,05).   Abschließend bleibt festzuhalten, dass ein assistierter Zonaschlupf beim Rind den Transfererfolg signifikant steigern kann. Ein besonders deutlicher Vorteil ergeben sich für die Embryonen sehr guter Qualität und für die aufgetaut transferierten Embryonen. Die Methode ist leicht und erfolgreich in kommerzielle Embryotransferprogramme zu integrieren.

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Rüther, Michael: Experimentelle Untersuchungen zum assistierten Zonaschlupf im Rahmen des kommerziellen Embryonentransfers beim Rind. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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