Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung und Evaluierung einer PCR zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae in Schweinelungen

Chrusciel, Dominika

Mycoplasma (M.). hyopneumoniae is the primary agent of enzootic pneumonia in pigs which produces high losses in pig rearing world-wide. The cultural detection of M. hyopneumoniae is time consuming and difficult. In this study two PCR methods were compared for a quick and reliable detection of M. hyopneumoniae in clinical specimen. The first method was a one-step-PCR described by BAUMEISTER et al. (1998). The primers flanked an 863 bp fragment of the M. hyopneumoniae genome. The other method was a nested-PCR performed according to STÄRK et al. (1998). In this PCR a 913 bp fragment was amplified with an outer primer pair, and an 808 bp fragment was amplified with an inner primer pair. In an european laboratory trial with 30 lung swabs M. hyopneumoniae could not be detected in any of the 25 lung swabs contaminated with M. hyopneumoniae by the PCR according to BAUMEISTER et al. (1998), whereas M. hyopneumoniae was detected in all positive samples by the nested-PCR. The false negative results of the one-step PCR used in this study could be explained by the variation of the DNA sequence within the primer binding region. Hence the nested-PCR according to STÄRK et al. (1998) was used in further investigations of 115 bronchial swabs. In addition the corresponding lungs were investigated by culture methods to isolate mycoplasmas. M. hyopneumoniae could not be isolated from the lungs, but was detected in 64 (56 %) bronchial swabs by nested-PCR. In further investigations M. hyopneumoniae could be detected in 10 out of 29 bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples by nested-PCR. In 4 of the PCR-positive BALFs M. hyopneumoniae was also detected by an immuno-fluorescence test (IFT) with antiserum specific for M. hyopneumoniae. To determine the prevalence of M. hyopneumoniae in wild boars, lung samples were taken and investigated by nested-PCR and IFT. Additionally sera from these wild boars were tested in an ELISA for antibodies to M. hyopneumoniae. An antibody response was detected in 37 of 75 serum samples (49.3 %). M. hyopneumoniae was detected in 43 of 81 lung samples (53 %) by IFT, and 42 of 72 (58.3 %) samples by nested-PCR. In 14 of 56 (25 %) wild boars M. hyopneumoniae-specific antibodies and also M. hyopneumoniae-specific gene sequences could be detected. Fifteen of 35 wild boars showed positive results in the IFT and also in the nested-PCR. In conclusion, due to the low specifity the PCR according to BAUMEISTER et al. (1998) seems not to be suited for routine diagnosis, whereas the PCR according to STÄRK et al. (1998) was sensitive and specific. This nested-PCR renders it possible to perform the detection of M. hyopneumoniae post mortem by investigation of lung samples and intra vitam by investigation of BALF. In addition it was shown that the prevalence of M. hyopneumoniae infection in both animal groups is similar, i. e. 56 % resp. 58 %. Wild boars are carriers of M. hyopneumoniae which could be a risk for domestic pig herds.

Mycoplasma (M.) hyopneumoniae ist das primäre ätiologische Agens der weltweit verbreiteten Enzootischen Pneumonie der Schweine, die zu hohen wirtschaftlichen Verlusten führen kann. Aufgrund der weiten Verbreitung wird im norddeutschen Raum nahezu flächendeckend geimpft. Eine Unterscheidung zwischen Impfantikörpern und Infektionsantikörpern ist mit serologischen Methoden derzeit nicht möglich. Der kulturelle Nachweis des Erregers ist zeitaufwendig und schwierig. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zwei PCR-Verfahren zum Nachweis von M. hyopneumoniae überprüft, die eine schnelle und zuverlässige Diagnostik gewährleisten sollen: Eine one-step-PCR nach BAUMEISTER et al. (1998) amplifizierte eine 863 bp große Sequenz aus dem Genom von M. hyopneumoniae. Die nested-PCR nach STÄRK et al. (1998) amplifizierte mit den äußeren Primern ein 913 bp großes Fragment und mit den inneren Primern ein 808 bp große DNA-Sequenz. Die one-step-PCR wies auch nach Optimierung der Reaktionsbedingungen eine verhältnismäßig geringe Sensitivität auf. In einer internationalen Laborvergleichsuntersuchung an 30 Lungentupfern konnte mit dieser PCR M. hyopneumoniae in keinem der positiven Lungentupfer nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden alle positiven Proben mit der nested-PCR detektiert. Die falsch-negativen Ergebnisse der one-step-PCR könnten mit einer Variation in der zu den Primern komplementären DNA-Sequenz bei den Feldstämmen von M. hyopneumoniae erklärt werden. Auf Grund der ungeeigneten Primer wird bei der one-step-PCR nach BAUMEISTER et al. (1998) zwar der M. hyopneumoniae Typstamm J erkannt, jedoch nicht die Mehrzahl der Feldstämme. Sie ist deshalb für die Routinediagnostik ungeeignet. Eine Untersuchung von 115 Bronchialtupfern von Schlachtschweinen erfolgte mittels nested-PCR nach STÄRK at al. (1998). Zusätzlich wurden die dazugehörenden Lungenproben kulturell und mittel Immunfluoreszenztest (IFT) untersucht. Die kulturellen Untersuchungen waren zumeist auf Grund von Kontaminationen mit anderen Bakterien nicht auswertbar. M. hyopneumoniae wurde kulturell nicht nachgewiesen. Dagegen wurde mit der nested-PCR in 64 Proben das spezifische DNA-Fragment amplifiziert. Die ermittelte Prävalenz von M. hyopneumoniae ergab 56 %. In der vorliegenden Arbeit wurden auch Untersuchungen an Lungen- und Serumproben von niedersächsischen Wildschweinen durchgeführt. Die Lungenproben wurden mittels nested-PCR und IFT auf M. hypneumoniae, die Serumproben auf Antikörper gegen M. hyopneumoniae untersucht. 49,3 % der Serumproben wiesen eine Antikörperaktivität gegen M. hyopneumoniae auf. Hier zeigte sich beim Vergleich der ELISA-Ergebnisse mit denen der nested-PCR eine Übereinstimmung bei 25 % (14 von 56). Bei einem Vergleich der nested-PCR mit dem IFT lag die Übereinstimmung positiver Nachweise bei 43 % (15 von 35). Die mit der nested-PCR ermittelte Prävalenz ergab 58,3 %. Die nested-PCR wurde zusätzlich an DNA, die von 29 bronchoalveolärern Lavage Flüssigkeit (BALF) geimpfter Läuferschweine extrahiert worden war, durchgeführt. Hierbei erwiesen sich 10 der untersuchten Proben als positiv (in Bezug auf M. hyopneumoniae). Im IFT waren 4 BALFs, in Übereinstimmung mit den PCR-Resultaten, positiv. Die nested-PCR nach STÄRK et al. (1998) wies die höchste Nachweisrate von M. hyopneumoniae bei den untersuchten Proben auf. Diese molekularbiologische Technik ermöglicht sowohl eine postmortale Diagnostik als auch, durch die Verwendung von Lungenspülproben, den Nachweis von M. hyopneumoniae am lebenden Tier, selbst bei geimpften Tieren. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem, dass die Prävalenz von M. hyopneumoniae bei Wildschweinen mit 58 % vergleichbar mit der Prävalenz bei Hausschweinen (56 %) ist. Die Wildschweinepopulation stellt also auch bezüglich der Enzootischen Pneumonie eine Gefahr für Hausschweinebestände dar.

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Chrusciel, Dominika: Etablierung und Evaluierung einer PCR zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae in Schweinelungen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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