Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Apoptose in Thekazellen des Rinderovars

Jörß, Bettina

While the normal ovarian cycle is the sequence of follicle maturation, ovulation, and corpus luteum formation, it should not be forgotten that the fate of most follicles in the ovary is the programmed cell death, the apoptosis. Disturbance of the apoptotic process can not only influence the ovarian function and the ability to reproduce of an organism considerably, but can also lead to cancerogenic transformation of cells. While one can go back to an extensive amount of literatur on apoptotic events in granulosa and luteal cells, little is known about the apoptosis of theca cells. The ability of theca cells of some species to undergo apoptosis has long been questioned. The aim of this dissertation was first of all to establish methods to induce and to prove apoptotic processes in theca cells. Bovine theca cells served as material to be examined since, on the one hand methods of isolation and in vitro cultivation were already established, and on the other very little was known about apoptotic processes in these cells. After the successful establishment of the methods, conditions which could influence the apoptosis in vitro were examined. The main emphasis was placed on the examination of the influence of lysophosphatidic acid (LPA). This substance can be found in high concentrations in the blood and ascites fluid of patients with ovarian cancer and can therefore be taken as a possible marker for ovarian carcinoma. Since LPA appears to produce resistance to certain chemotherapeutic agents used in the cancer therapy of other cell systems, it was of greatest interest to examine whether it would influence the apoptosis in theca cells. Initially a suitable cell culture system was established, with which the apoptotic processes on molecular level could be examined. A cell culture system of primary bovine theca cells from material from a slaughter house was successfully build up, using the experiences of the Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung in the cultivation of these cells in a modified form. Although bovine theca cells are very resistant to the induction of apoptosis in vitro, it was possible to induce apoptosis at least in a part of the cells through different approaches. That apoptosis had taken place was proved by various methods: 1) morphologically by examination through phase contrast and fluorescence microscopy after staining of DNA with bisbenzimide, 2) examination of DNA integrity after electrophoretic separation and DNA staining with ethidiumbromide (DNA-laddering) and 3) evaluation of the amount of baxprotein, which plays a proapoptotic role in the intrinsic apoptotic pathway by means of western blot and proof of the exsistance of the corresponding RNA by means of RT-PCR. It was possible to induce apoptosis in cultured theca cells through long-term withdrawal of serum and by incubation with substances with a cytostatic effect, such as cytocholasin B, paclitaxel, etoposide and TNFα in combination with ceramid 2. First results indicate the ability of LPA to at least partly compensate the apoptotic effect of the withdrawal of serum.

Obwohl der ovarielle Zyklus im wesentlichen aus einer Abfolge von Follikelreifung, Ovulation, Corpus luteum Bildung und Luteolyse besteht, darf nicht vergessen werden, dass das Schicksal der meisten Follikel der programmierte Zelltod, die Apoptose, ist. Störungen der Apoptose können nicht nur die Ovarfunktion und damit die Reproduktionsfähigkeit eines Organismus erheblich beeinflussen, sondern führen auch zu kanzerogenen Transformationen. Während man jedoch auf eine umfangreiche Literatur über apoptotische Vorgänge in Granulosa- und Lutealzellen verschiedener Spezies zurückgreifen kann, ist relativ wenig über die Apoptose in Thekazellen bekannt. Bei einigen Spezies wurde die Fähigkeit der Thekazellen, in Apoptose zu gehen, lange in Frage gestellt. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst Methoden zu etablieren, die ermöglichen, Thekazellen gezielt in die Apoptose zu bringen und diese eindeutig nachzuweisen. Als Untersuchungsmaterial dienten Thekazellen des Rindes, da einerseits bereits Isolierungsmethoden und in vitro Zellkulturbedingungen etabliert sind, andererseits wenig über deren Apoptoseverhalten bekannt ist. Nach erfolgreicher Etablierung der Methoden sollten Bedingungen untersucht werden, die die Apoptose in vitro beeinflussen können. Der Schwerpunkt sollte dabei auf der Untersuchung des Einflusses der Lysophosphatidsäure (LPA) liegen. Dieses Molekül ist bei Ovarkarzinomen in hoher Konzentration im Blut und im Aszites zu finden und wird somit als ein möglicher Marker für Ovarkarzinome angesehen. Da es jedoch in anderen Zellsystemen eine Resistenz gegen bestimmte, in der Krebstherapie verwendete Chemotherapeutika hervorzurufen scheint, war es interessant, zu untersuchen, ob LPA die Apoptose in Thekazellen in vitro beeinflussen kann.   Zunächst wurde ein geeignetes Zellkultursystem etabliert, das die Möglichkeit bot, die Vorgänge der Apoptose auf molekularer Ebene zu untersuchen. Es gelang der Aufbau primärer Zellkulturen boviner Thekazellen aus Schlachthofmaterial. Hierfür konnten am Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung gesammelte Erfahrungen in der Kultivierung dieser Zellen modifiziert werden. Obwohl Thekazellen des Rindes in vitro sehr resistent gegen die Einleitung der Apoptose sind, ist es mir gelungen durch verschiedene Ansätze zumindest einen Teil der Zellen in die Apoptose zu bringen. Die Apoptose wurde durch verschiedene Methoden nachgewiesen, als da sind: morphologische Kriterien mit Hilfe von Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie nach Färbung der DNA mit BisBenzimid, Untersuchungen der Integrität der DNA nach elektrophoretischer Auftrennung und Färbung mit Ethidiumbromid („Laddering“), Bestimmung der Menge des Proteins Bax, das eine proapoptotische Funktion in dem intrinsischen Apoptoseweg spielt, durch Western Blot sowie den Nachweis der entsprechenden RNA mit Hilfe der Reverse-Transkriptase-PCR.   Es war möglich, die Apoptose in kultivierten Thekazellen durch langfristigen Serumentzug und durch Inkubation mit cytostatisch wirksamen Substanzen wie Cytocholasin B, Paclitaxel, Etoposide und TNFα in Kombination mit Ceramid 2 einzuleiten. Erste Ergebnisse deuten daraufhin, dass LPA die apoptotische Wirkung von Serumentzug teilweise aufheben kann.

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Jörß, Bettina: Untersuchung zur Apoptose in Thekazellen des Rinderovars. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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