Improved fertility of flowcytometrically sex selected bull spermatozoa

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden der Einfluss der Flowzytometrie sowie die Auswirkung unterschiedlich modifizierter Verdünnerprotokolle auf die Lebensfähigkeit und Befruchtungskapazität von bovinem Frisch- und Tiefgefriersperma analysiert. Die Untersuchung gliedert sich in vier Abschnitte. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden die Auswirkungen der Tiefgefrierung auf Qualität und Befruchtungskapazität flowzytometrisch sortierter Bullenspermien analysiert. Das zu untersuchende Sperma wurde von zwei befruchtungskompetenten Bullen der Rasse „Holstein Friesian“ gewonnen. Die Qualität des Tiefgefrierspermas wurde hinsichtlich Spermienmotilität, Spermienmorphologie sowie der Ergebnisse eines Membranstabilitätstestes (6-CFDA/PI) und eines Kapazitationstestes (FITC-PNA/PI; Induktion mit L-α-Lysophosphatidylcholine –LPC-) ermittelt. Außerdem wurde die Befruchtungsfähigkeit der Spermien im Feldversuch überprüft. Eine verlängerte Inkubation von stark verdünntem gesextem Sperma vor der Tiefgefrierung hatte einen signifikant (P<0,05) negativen Effekt auf die Spermienmotilität und Spermienkapazitation. Positive Auswirkungen auf die Membranstabilität wurden erzielt, wenn Glyzerin erst nach Anpassung auf 5°C kurz vor der Tiefgefrierung zugegeben wurde (p<0,05). Glyzerinzugabe bereits während der Äquilibrierungsphase bei Raumtemperatur zeigte dagegen keine Veränderungen Außerdem wurde ein Thermoresistenztest bei 37°C mit gesextem (im Anschluss an Zentrifugation und Glyzerinzugabe bei 5°C) und bei ungesextem Tiefgefriersperma durchgeführt. Unmittelbar nach dem Auftauvorgang unterschied sich die Motilität zwischen gesexten und ungesexten Spermien nicht. Wurden die Spermien jedoch einer weiteren Inkubation bei 37°C unterzogen, verringerte sich deren Motilität jeweils nach drei (P<0,001) und sechs (P<0,05) Stunden. Gesexte und ungesexte Spermien eines Ejakulates wurden im Feldversuch eingesetzt. Dabei wurden Färsen und Kühe bei spontaner Brunst oder nach hormoneller Synchronisation durch das Stallpersonal besamt. Wurde der optimale Besamungszeitpunkt durch Brunstbeobachtung ermittelt, führte eine künstliche Besamung mit ungesextem Sperma (56,5 %) zu einer höheren Trächtigkeitsrate (P<0,001) als unter Verwendung von gesextem Sperma (17,6 %). Die Besamung hormonell synchronisierter Tiere hatte keine unterschiedlichen Trächtigkeitsraten zur Folge (36,4 % ungesextes Sperma, 21,3 % gesextes Sperma). Die Qualität von gesextem, tiefgefrorenem Bullensperma nach Zugabe von Antioxidantien wurde im zweiten Teil dieser Untersuchung verbessert. Von zwei Bullen der Rasse „Holstein Friesian“ wurden insgesamt 12 Ejakulate gewonnen. Jedes dieser Ejakulate wurde in drei Untersuchungsproben aufgeteilt. Zwei Proben wurden auf der Grundlage der „Beltsville Sperm Sexing Technologie“ sortiert, wobei einer Probe jeweils verschiedene Antioxidantien (S-AO) bereits vor dem Sortiervorgang zugesetzt wurden. Eine dritte unsortierte Probe diente als Kontrolle. Alle drei Proben, mit Ausnahme der vor dem Sortiervorgang mit Antioxidantien versetzten Probe, wurden nach dem gleichen Gefrierprotokoll behandelt. Bei Proben, die bereits in Gegenwart der Antioxidantien sortiert wurden, erfolgte die Tiefgefrierung mit einem Antioxidantien enthaltenden TRIS-Eidotter-Verdünner. Zur Bestimmung der Spermienqualität wurden nach dem Auftauvorgang die Spermienmorphologie sofort nach Auftauen der Pailletten und die Spermienmotilität ermittelt. Die Spermienmotilität wurde durch einen Thermoresistenztest nach 0, 6, 12 und 24 Stunden Inkubation bei 37°C analysiert. Außerdem wurden die Spermien mit FITC-PNA/PI fixiert und nach 0, 12 und 24 Stunden Inkubation bei 37°C untersucht. Spermien, die in der Gegenwart von Antioxidantien sortiert wurden (S-AO), waren zu allen Analysezeiten beweglicher (P<0,05) als die ohne Zusätze gesexten Spermien. Sie waren auch nach 0, 6 und 24 Stunden beweglicher als die Spermien der Kontrollgruppe. Der Prozentsatz an Spermien mit geschädigtem Akrosom war in der S-AO-Gruppe (20,8 ± 6,9 %) signifikant geringer (P<0,05) als in der unsortierten Kontrollgruppe (30,3 ± 12,0%). Die S-AO-Gruppe enthielt auch weniger (P<0,05) morphologisch veränderte Spermien (25,8 ± 5,2%) als die unsortierte (36,0 ± 12,5%) und die ohne Antioxidantien sortierte (35,1 ± 7,4%) Gruppe. Keine Unterschiede konnten in der Membranbeschaffenheit der Spermien zwischen den Gruppen festgestellt werden, die im Anschluss und 12 Stunden nach dem Sortiervorgang mittels FITC/PI fixiert wurden. Nach 24 Stunden Inkubation besaßen die aufgetauten Spermien der S-AO-Gruppe einen signifikant (P<0,001) höheren Prozentsatz (40,7 ± 6,3 %) an unveränderten Membranen im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen (unsortiert: 7,8 ± 4,7 %; ohne Antioxidantien sortiert: 7,4 ± 4,6 %). Nach dem Auftauen und einer Inkubation für 0, 12 und 24 Stunden erfolgte die Akrosomreaktion bei prozentual weniger (P<0,05) Spermien der S-AO-Gruppe (14,1 ± 7,5 %; 23,4 ± 5,4 %; 28,8 ± 6,3 %) als bei ungesexten Spermien (25,9 ± 14,4 %; 38,5 ± 16,75 %; 79,8 ± 4,1 %) und herkömmlich gesexten Spermien nach 24 stündiger Inkubation (67,3 ± 10,05). Diese Ergebnisse zeigen erstmals den positiven Effekt von antioxidativen Substanzen auf die Qualität von gesexten und tiefgefrorenen Bullenspermien. Um die Spermien während des Sortiervorgangs und der anschließenden Tiefgefrierung zu schützen, wurde im dritten Teil dieser Arbeit ein veränderter TRIS-Verdünner zum Einsatz gebracht. Dabei wurde ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Verdünner mit einer spezifischen Kombination an Antioxidantien (AO) und bovinem Serumalbumin (BSA) verwendet. Dieser Verdünner erhöhte die Qualität des gesexten Spermas, und es konnte kein Unterschied weder in der Spermienmotilität noch der Membranbeschaffenheit, die durch FITC-PNA/PI-Färbung ermittelt wurde, zwischen den drei Gruppen beobachtet werden (P>0,05). Im Vergleich zu nicht gesexten Spermien war die Akrosomintegrität in der AO/BSA-Gruppe nach 24 und 48 Stunden Inkubation bei 15°C und in der AO-Gruppe ohne BSA-Zusatz nach 48 stündiger Inkubation besser (P<0,05). Künstlich besamte Färsen nach Brunstbeobachtung wurden durch Sperma aller drei Gruppen in gleichem Maße trächtig (66,7 % ungesexte Spermien; 58,1 % AO/BSA; 54,5 % AO). Außerdem konnten wir erstmalig zeigen, dass sich gesexte Spermien erfolgreich innerhalb von 72 Stunden nach dem Sortiervorgang zur künstlichen Besamung eignen. Im vierten Teil der Untersuchung wurden die Auswirkungen von Antioxidantien und reversibel inhibierter Spermienmotilität auf die Qualität und Befruchtungskapazität von gesextem Tiefgefriersperma analysiert. Dabei wurden die Spermien sowohl vor als auch nach dem flowzytometrischen Sortiervorgang in ihrer Beweglichkeit gehemmt und ihre Qualität und Befruchtungsfähigkeit ermittelt. Drei verschieden behandelte Spermiengruppen waren Bestandteil dieser Untersuchung: Gehemmte Spermien, die in Gegenwart von Natriumfluorit (S-AO-NF) sortiert wurden, nach einem Standardprotokoll gesexte Spermien (S-AO) und ungesexte Spermien, die als Kontrolle dienten (C). Im Feldversuch wurden in 197 Betrieben insgesamt 283 Erstbesamungen mit gesextem und ungesextem Tiefgefriersperma von zwei verschiedenen Bullen durchgeführt. Jede Besamungsdosis enthielt 2 Millionen lebende Spermienzellen. Spermien, die mit Natriumfluorit behandelt wurden, waren vollständig unbeweglich, gewannen ihre ursprüngliche Beweglichkeit jedoch nach dem Sortiervorgang und anschließender Zentrifugation wieder zurück. Die Spermienmotilität unterschied sich nach dem Auftauvorgang und anschließender Inkubation bei 37°C nicht zwischen den einzelnen Gruppen. Eine verlängerte Inkubation bei 37°C für 12 und 24 Stunden erhöhte die Spermienmotilität (P<0,001) in beiden sortierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe (S-AO-NF: 37,1 ± 4,9 %; 22,9 ± 7,6 % vs. S-AO: 33,1 ± 6,5 %; 21,3 ± 10,3 % vs. C: 7,5 ± 11,6 %; 0,0 ± 0,0 %). Der Prozentsatz an akrosomveränderten Spermien (AR) war höher (P<0,05) in der S-AO- und C-Gruppe als in der S-AO-NF-Gruppe (23,0 ± 5,2 %; 22,3 ± 4,0 %; 14,7 ± 7,5 %). Ähnliche Unterschiede konnten für morphologisch veränderte Spermien ermittelt werden (30,0 ± 6,7 %; 29,0 ± 5,8 %; 19,0 ± 8,1 %). Der Prozentsatz an lebenden Spermien, bei denen bereits eine Akrosomreaktion erfolgt war, wurde mittels FITC-PNA/PI-Fixierung analysiert. Dabei hatten prozentual weniger (P<0,001) Spermien aus den beiden gesexten Gruppen (S-AO: 10,6 ± 3,5 %; S-AO-NF: 6,7 ± 2,6 %) eine Akrosomreaktion erfahren als Spermien der Kontrollgruppe (19,1 ± 4,7 %). Außerdem konnte in der S-AO-NF-Gruppe (72,1 ± 5,0 %) eine höhere Anzahl lebender Spermien (P<0,05) beobachtet werden als in der S-AO- und Kontrollgruppe (56,9 ± 4,7 %; 61,4 ± 8,2 %). Keine Unterschiede gab es in der Trächtigkeitsrate (S-AO-NF: 72,7 %, S-AO: 73,3 %; C: 79,2 %). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass durch eine veränderte Zusammensetzung des Verdünners und spezielle Behandlungen der Spermien vor, während und nach dem Sortierungsvorgang die Qualität und Befruchtungsfähigkeit von gesexten Spermien erfolgreich an die des ungesexten Spermas angenähert werden können. Bei ausgewählten Bullen sind dementsprechend auch keine speziellen Besamungsverfahren erforderlich.