Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Improved fertility of flowcytometrically sex selected bull spermatozoa

Klinc, Primož

The influence of flowcytometrical sorting and the effect of different modifications of extenders on the viability and fertilizing capacity of liquid and frozen/thawed bull spermatozoa were analysed in the present study. The study was divided in four experimental parts. The aims of the first study were to analyze effects of semen processing after sorting and subsequent freezing in liquid nitrogen on the quality and fertilizing capacity of bull spermatozoa. Semen was obtained from two fertility proven Holstein Friesian bulls. Quality of the frozen/thawed semen was evaluated by motility estimation, morphology analysis, membrane stability (6-CFDA/PI) test, capacitation test (FITC-PNA/PI staining with L-α-Lysophosphatidylcholine), and fertility assessment in an insemination trial on farm. A prolonged period after high dilution of sorted spermatozoa before freezing had a significantly negative effect on motility (P<0.001) and capacitation status (P<0.05). Positive effects on membrane stability were seen, when glycerol was added at 5°C shortly before straws were frozen, compared to a system where glycerol was added before the equilibration process at room temperature (P<0.001). Independently from sperm processing after sorting, sexed spermatozoa had significantly more damaged acrosomes and morphological abnormalities (P<0.001). In addition, sex sorted frozen/thawed spermatozoa (immediate centrifugation and glycerol addition at 5°C) and unsorted frozen/thawed semen samples were submitted to a thermo-resistance test at 37°C. Immediately after thawing no significant difference was seen in the percentage of motile spermatozoa between sorted and unsorted semen samples. However, after further incubation at 37°C, motility dropped significantly after 3 h (P<0.001) and 6 h (P<0.05). The fertilizing capacity of sex-sorted and unsorted spermatozoa from same ejaculates was tested in a field trial in heifers and cows with natural or synchronised oestrus cycle, respectively. In natural oestrus, more animals became pregnant after artificial insemination with unsorted than with sex-sorted spermatozoa (56.5 % vs. 17.6 %; P<0.001). No significant differences were observed between unsorted and sex-sorted frozen/thawed semen samples after artificial insemination of the animals with synchronized estrus (36.4 % vs. 21.3 %). The goal of the second study was to investigate the effect of antioxidant supplementation on the quality of frozen/thawed sexed bull spermatozoa. Twelve ejaculates from two Holstein Friesian bulls were sorted according to the Beltsville Sperm Sexing Technology. Each ejaculate was divided into three parts and processed as unsorted control, according to a standard sorting protocol and in the presence of different antioxidants (S-AO). Cooling and freezing of the samples was performed equally for all three groups, except that antioxidants were added to TRIS-egg-yolk freezing extender for those semen samples that were already sorted in the presence of antioxidants. The semen quality in frozen/thawed samples was determined by morphology analysis immediately after thawing, motility estimation in a thermo-resistance test after 0, 6, 12 and 24 h incubation at 37°C and FITC-PNA/PI staining after 0, 12 and 24 h of incubation at 37°C. Assessment of motility showed significantly more (P<0.05) motile spermatozoa in S-AO samples as compared to unsorted frozen/thawed controls at 0, 6 and 24 h after thawing and compared to normally sorted samples at all times after thawing. Percentage of damaged acrosomes was significantly lower (P<0.05) in S-AO samples in comparison to unsorted control (20.8 ± 6.9 % and 30.3 ± 12.0 %, respectively) and the percentage of morphological abnormal spermatozoa was in this group significantly lower (P<0.05) in comparison to unsorted control and normally sorted samples (25.8 ± 5.2 %; 36.0 ± 12.5 % and 35.1 ± 7.4 %, respectively). Analysis of frozen/thawed spermatozoa with FITC/PI revealed no significant difference in membrane integrity at 0 and 12 hours after sorting, but after 24 hours incubation the S-AO samples had significantly higher (P<0.001) percentage of spermatozoa with intact membranes in comparison to unsorted control and normally sorted semen (40.7 ± 6.3 %; 7.8 ± 4.7 % and 7.4 ± 4.6 % respectively). Percentage of acrosome reacted spermatozoa was significantly lower (P<0.05) in the S-AO samples in comparison to unsorted controls (14.1 ± 7.5 % vs. 25.9 ± 14.4 %; 23.4 ± 5.4 % vs. 38.5 ± 16.7 % and 28.8 ± 6.3 % vs. 79.8 ± 4.1 % respectively) for 0, 12, 24 h after thawing and in comparison to normally sorted semen 24 hours after thawing (67.3 ± 10.0 %). This study shows for the first time the highly beneficial protective effect of antioxidative substances on the quality of sexed, frozen thawed bull semen. In the third study, modifications of a TRIS extender were used to balance major cells damages caused by the sorting process and liquid storing of the sorted spermatozoa. In order to prolong lifetime of sorted spermatozoa a special designed combination of antioxidants (AO) and bovine serum albumin (BSA) was used. The new extender increased the quality of sexed semen and no significant difference were seen in motility between unsorted controls and samples, sorted in the presence of AO and BSA. Similarly, membrane integrity as tested by FITC-PNA/PI did not differ significantly to controls. Acrosome integrity was significantly better in AO/BSA sorted group 24 and 48 hours after incubation at 15°C (P<0.05) and also after 48 hours in the AO group without BSA (P<0.05) in comparison to unsorted control semen. There was no significant difference in pregnancy rates between unsorted control (66.7 %) and both sorted groups (AO/BSA (58.1 %) and AO (54.5 %) when semen was inseminated in non-synchronised heifers. Additionally, we could show for the first time that liquid sorted semen can be inseminated successfully within 72 hours after sorting. The aim of the fourth study was to analyse the effect of antioxidants and temporary chemical inhibition of sperm motility before and during flowcytometrical sorting on the quality and fertilizing capacity of sex sorted and frozen/thawed spermatozoa. The quality and fertilizing capacity of temporarily immobilized spermatozoa sorted in the presence of sodium fluoride (S-AO-NF) was compared with sorted semen using a standard protocol as developed in our laboratory (S-AO) and with unsorted control (C). Semen from two bulls was used and in total 283 first inseminations with 2 million live, frozen/thawed sex sorted and unsorted spermatozoa were performed on 197 farms. After addition of sodium fluoride the motility of spermatozoa was completely inhibited and after sorting and centrifugation returned to a similar degree as before. Motility after thawing and incubation at 37°C did not differ between groups. After further incubation at 37°C for 12 h and 24 h motility was significant higher (P<0.001) in both sorted groups compared to unsorted semen (37.1 ± 4.9 %vs. 33.1 ± 6.5 % vs. 7.5 ± 11.6 % and 22.9 ± 7.6 % vs. 21.3 ± 10.3 % vs. 0.0 ± 0.0 % for S-AO-NF vs. S-AO vs. C for 12 and 24 hours respectively). The percentage of spermatozoa with acrosome abnormalities in frozen/thawed samples was significantly higher (P<0.05) in S-AO and C group when compared to S-AO-NF (23.0 ± 5.2 %, 22.3 ± 4.0 % and 14.7 ± 7.5 % respectively). The same difference was found for morphological sperm abnormalities (30.0 ± 6.7 %, 29.0 ± 5.8 % and 19.0 ± 8.1 % respectively). The percentage of acrosome reacted (AR) and viable spermatozoa was analysed by FITC-PNA/PI staining. The percentage of AR spermatozoa was significantly lower (P<0.001) in both groups of sorted semen when compared to unsorted control (10.6 ± 3.5 % vs. 6.7 ± 2.6 % vs. 19.1 ± 4.7 % for S-AO, S-AO-NF and C respectively). In addition, the percentage of viable spermatozoa was significantly higher (P<0.05) in the S-AO-NF group when compared to groups S-AO and C (72.1 ± 5.0 % vs. 56.9 ± 4.7 % vs. 61.4 ± 8.2 % respectively). Pregnancy rates after artificial insemination with the frozen/thawed semen were not significantly different between sorted spermatozoa and controls (72.7 % vs. 73.3 % vs. 79.2 % for S-AO-NF, S-AO and C respectively). In conclusion, this study showed that reduction in quality and fertilizing capacity of sex sorted spermatozoa can be successfully prevented by modifications of extenders and handling of the semen before, during and after sperm sorting.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurden der Einfluss der Flowzytometrie sowie die Auswirkung unterschiedlich modifizierter Verdünnerprotokolle auf die Lebensfähigkeit und Befruchtungskapazität von bovinem Frisch- und Tiefgefriersperma analysiert. Die Untersuchung gliedert sich in vier Abschnitte. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden die Auswirkungen der Tiefgefrierung auf Qualität und Befruchtungskapazität flowzytometrisch sortierter Bullenspermien analysiert. Das zu untersuchende Sperma wurde von zwei befruchtungskompetenten Bullen der Rasse „Holstein Friesian“ gewonnen. Die Qualität des Tiefgefrierspermas wurde hinsichtlich Spermienmotilität, Spermienmorphologie sowie der Ergebnisse eines Membranstabilitätstestes (6-CFDA/PI) und eines Kapazitationstestes (FITC-PNA/PI; Induktion mit L-α-Lysophosphatidylcholine –LPC-) ermittelt. Außerdem wurde die Befruchtungsfähigkeit der Spermien im Feldversuch überprüft. Eine verlängerte Inkubation von stark verdünntem gesextem Sperma vor der Tiefgefrierung hatte einen signifikant (P<0,05) negativen Effekt auf die Spermienmotilität und Spermienkapazitation. Positive Auswirkungen auf die Membranstabilität wurden erzielt, wenn Glyzerin erst nach Anpassung auf 5°C kurz vor der Tiefgefrierung zugegeben wurde (p<0,05). Glyzerinzugabe bereits während der Äquilibrierungsphase bei Raumtemperatur zeigte dagegen keine Veränderungen Außerdem wurde ein Thermoresistenztest bei 37°C mit gesextem (im Anschluss an Zentrifugation und Glyzerinzugabe bei 5°C) und bei ungesextem Tiefgefriersperma durchgeführt. Unmittelbar nach dem Auftauvorgang unterschied sich die Motilität zwischen gesexten und ungesexten Spermien nicht. Wurden die Spermien jedoch einer weiteren Inkubation bei 37°C unterzogen, verringerte sich deren Motilität jeweils nach drei (P<0,001) und sechs (P<0,05) Stunden. Gesexte und ungesexte Spermien eines Ejakulates wurden im Feldversuch eingesetzt. Dabei wurden Färsen und Kühe bei spontaner Brunst oder nach hormoneller Synchronisation durch das Stallpersonal besamt. Wurde der optimale Besamungszeitpunkt durch Brunstbeobachtung ermittelt, führte eine künstliche Besamung mit ungesextem Sperma (56,5 %) zu einer höheren Trächtigkeitsrate (P<0,001) als unter Verwendung von gesextem Sperma (17,6 %). Die Besamung hormonell synchronisierter Tiere hatte keine unterschiedlichen Trächtigkeitsraten zur Folge (36,4 % ungesextes Sperma, 21,3 % gesextes Sperma). Die Qualität von gesextem, tiefgefrorenem Bullensperma nach Zugabe von Antioxidantien wurde im zweiten Teil dieser Untersuchung verbessert. Von zwei Bullen der Rasse „Holstein Friesian“ wurden insgesamt 12 Ejakulate gewonnen. Jedes dieser Ejakulate wurde in drei Untersuchungsproben aufgeteilt. Zwei Proben wurden auf der Grundlage der „Beltsville Sperm Sexing Technologie“ sortiert, wobei einer Probe jeweils verschiedene Antioxidantien (S-AO) bereits vor dem Sortiervorgang zugesetzt wurden. Eine dritte unsortierte Probe diente als Kontrolle. Alle drei Proben, mit Ausnahme der vor dem Sortiervorgang mit Antioxidantien versetzten Probe, wurden nach dem gleichen Gefrierprotokoll behandelt. Bei Proben, die bereits in Gegenwart der Antioxidantien sortiert wurden, erfolgte die Tiefgefrierung mit einem Antioxidantien enthaltenden TRIS-Eidotter-Verdünner. Zur Bestimmung der Spermienqualität wurden nach dem Auftauvorgang die Spermienmorphologie sofort nach Auftauen der Pailletten und die Spermienmotilität ermittelt. Die Spermienmotilität wurde durch einen Thermoresistenztest nach 0, 6, 12 und 24 Stunden Inkubation bei 37°C analysiert. Außerdem wurden die Spermien mit FITC-PNA/PI fixiert und nach 0, 12 und 24 Stunden Inkubation bei 37°C untersucht. Spermien, die in der Gegenwart von Antioxidantien sortiert wurden (S-AO), waren zu allen Analysezeiten beweglicher (P<0,05) als die ohne Zusätze gesexten Spermien. Sie waren auch nach 0, 6 und 24 Stunden beweglicher als die Spermien der Kontrollgruppe. Der Prozentsatz an Spermien mit geschädigtem Akrosom war in der S-AO-Gruppe (20,8 ± 6,9 %) signifikant geringer (P<0,05) als in der unsortierten Kontrollgruppe (30,3 ± 12,0%). Die S-AO-Gruppe enthielt auch weniger (P<0,05) morphologisch veränderte Spermien (25,8 ± 5,2%) als die unsortierte (36,0 ± 12,5%) und die ohne Antioxidantien sortierte (35,1 ± 7,4%) Gruppe. Keine Unterschiede konnten in der Membranbeschaffenheit der Spermien zwischen den Gruppen festgestellt werden, die im Anschluss und 12 Stunden nach dem Sortiervorgang mittels FITC/PI fixiert wurden. Nach 24 Stunden Inkubation besaßen die aufgetauten Spermien der S-AO-Gruppe einen signifikant (P<0,001) höheren Prozentsatz (40,7 ± 6,3 %) an unveränderten Membranen im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen (unsortiert: 7,8 ± 4,7 %; ohne Antioxidantien sortiert: 7,4 ± 4,6 %). Nach dem Auftauen und einer Inkubation für 0, 12 und 24 Stunden erfolgte die Akrosomreaktion bei prozentual weniger (P<0,05) Spermien der S-AO-Gruppe (14,1 ± 7,5 %; 23,4 ± 5,4 %; 28,8 ± 6,3 %) als bei ungesexten Spermien (25,9 ± 14,4 %; 38,5 ± 16,75 %; 79,8 ± 4,1 %) und herkömmlich gesexten Spermien nach 24 stündiger Inkubation (67,3 ± 10,05). Diese Ergebnisse zeigen erstmals den positiven Effekt von antioxidativen Substanzen auf die Qualität von gesexten und tiefgefrorenen Bullenspermien. Um die Spermien während des Sortiervorgangs und der anschließenden Tiefgefrierung zu schützen, wurde im dritten Teil dieser Arbeit ein veränderter TRIS-Verdünner zum Einsatz gebracht. Dabei wurde ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Verdünner mit einer spezifischen Kombination an Antioxidantien (AO) und bovinem Serumalbumin (BSA) verwendet. Dieser Verdünner erhöhte die Qualität des gesexten Spermas, und es konnte kein Unterschied weder in der Spermienmotilität noch der Membranbeschaffenheit, die durch FITC-PNA/PI-Färbung ermittelt wurde, zwischen den drei Gruppen beobachtet werden (P>0,05). Im Vergleich zu nicht gesexten Spermien war die Akrosomintegrität in der AO/BSA-Gruppe nach 24 und 48 Stunden Inkubation bei 15°C und in der AO-Gruppe ohne BSA-Zusatz nach 48 stündiger Inkubation besser (P<0,05). Künstlich besamte Färsen nach Brunstbeobachtung wurden durch Sperma aller drei Gruppen in gleichem Maße trächtig (66,7 % ungesexte Spermien; 58,1 % AO/BSA; 54,5 % AO). Außerdem konnten wir erstmalig zeigen, dass sich gesexte Spermien erfolgreich innerhalb von 72 Stunden nach dem Sortiervorgang zur künstlichen Besamung eignen. Im vierten Teil der Untersuchung wurden die Auswirkungen von Antioxidantien und reversibel inhibierter Spermienmotilität auf die Qualität und Befruchtungskapazität von gesextem Tiefgefriersperma analysiert. Dabei wurden die Spermien sowohl vor als auch nach dem flowzytometrischen Sortiervorgang in ihrer Beweglichkeit gehemmt und ihre Qualität und Befruchtungsfähigkeit ermittelt. Drei verschieden behandelte Spermiengruppen waren Bestandteil dieser Untersuchung: Gehemmte Spermien, die in Gegenwart von Natriumfluorit (S-AO-NF) sortiert wurden, nach einem Standardprotokoll gesexte Spermien (S-AO) und ungesexte Spermien, die als Kontrolle dienten (C). Im Feldversuch wurden in 197 Betrieben insgesamt 283 Erstbesamungen mit gesextem und ungesextem Tiefgefriersperma von zwei verschiedenen Bullen durchgeführt. Jede Besamungsdosis enthielt 2 Millionen lebende Spermienzellen. Spermien, die mit Natriumfluorit behandelt wurden, waren vollständig unbeweglich, gewannen ihre ursprüngliche Beweglichkeit jedoch nach dem Sortiervorgang und anschließender Zentrifugation wieder zurück. Die Spermienmotilität unterschied sich nach dem Auftauvorgang und anschließender Inkubation bei 37°C nicht zwischen den einzelnen Gruppen. Eine verlängerte Inkubation bei 37°C für 12 und 24 Stunden erhöhte die Spermienmotilität (P<0,001) in beiden sortierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe (S-AO-NF: 37,1 ± 4,9 %; 22,9 ± 7,6 % vs. S-AO: 33,1 ± 6,5 %; 21,3 ± 10,3 % vs. C: 7,5 ± 11,6 %; 0,0 ± 0,0 %). Der Prozentsatz an akrosomveränderten Spermien (AR) war höher (P<0,05) in der S-AO- und C-Gruppe als in der S-AO-NF-Gruppe (23,0 ± 5,2 %; 22,3 ± 4,0 %; 14,7 ± 7,5 %). Ähnliche Unterschiede konnten für morphologisch veränderte Spermien ermittelt werden (30,0 ± 6,7 %; 29,0 ± 5,8 %; 19,0 ± 8,1 %). Der Prozentsatz an lebenden Spermien, bei denen bereits eine Akrosomreaktion erfolgt war, wurde mittels FITC-PNA/PI-Fixierung analysiert. Dabei hatten prozentual weniger (P<0,001) Spermien aus den beiden gesexten Gruppen (S-AO: 10,6 ± 3,5 %; S-AO-NF: 6,7 ± 2,6 %) eine Akrosomreaktion erfahren als Spermien der Kontrollgruppe (19,1 ± 4,7 %). Außerdem konnte in der S-AO-NF-Gruppe (72,1 ± 5,0 %) eine höhere Anzahl lebender Spermien (P<0,05) beobachtet werden als in der S-AO- und Kontrollgruppe (56,9 ± 4,7 %; 61,4 ± 8,2 %). Keine Unterschiede gab es in der Trächtigkeitsrate (S-AO-NF: 72,7 %, S-AO: 73,3 %; C: 79,2 %). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass durch eine veränderte Zusammensetzung des Verdünners und spezielle Behandlungen der Spermien vor, während und nach dem Sortierungsvorgang die Qualität und Befruchtungsfähigkeit von gesexten Spermien erfolgreich an die des ungesexten Spermas angenähert werden können. Bei ausgewählten Bullen sind dementsprechend auch keine speziellen Besamungsverfahren erforderlich.

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Klinc, Primož: Improved fertility of flowcytometrically sex selected bull spermatozoa. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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