Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung und Validierung einer PCR in der Routinediagnostik zum Nachweis von Rhodococcus equi in Untersuchungsmaterial aus dem Atemtrakt von Fohlen

Lorenz, Nicole

Rhodococcus equi is a bacterial infectious agent occuring worldwide and one of the most important causes of disease in foals between 1 and 6 months of age. The disease is characterized by subacute to chronic bronchopneumonia with pulmonary abscesses. Rarely intestinal manifestations are accompanied by enteritis and mesenteric lymphadenopathy. The main purpose of this study was to detect Rhodococcus equi by PCR from nasal swabs and tracheobronchial secretions collected from foals with clinical signs of pneumonia and sonographical signs of abscessation. Described PCR-methods were tested and adapted for their suitability in routine diagnostics. The specificity of each PCR was examined by testing of 20 closed related and diagnostically important bacteria species. The PCR was compared to the clinical and cultural results with respect to the different materials. In this study 123 isolates and 158 swabs were examined. It was shown that the already described 16S-PCR is only useful for identification of isolates on species level and the VapA-PCR only for detection of Rhodococcus equi containing a virulence-associated plasmid. The published sequences of the cholesteroloxidase gene showed a high identity to Brevibacterium sterolicum and Streptomyces coelicolor in sequence database analysis and was therefore also not suitable for routine diagnostics. The IupA-PCR, the IdeR500-PCR and the AceA500-PCR delivered the best results compared to clinical and cultural results particularly in tracheobronchial secretions and media-containing swabs. Finally, it was demonstrated that the highest sensitivity and specificity was obtained by a combination of IupA-PCR with IdeR500-PCR or AceA500-PCR in kind of a duplex-PCR or 2 simplex-PCRs in parallel. Hence, the use of these PCRs is recommended for screening and monitoring in routine diagnostics. To increase sensitivity further research on DNA-preparation and selective enrichment of the germ should be tested for optimising the method.

Rhodococcus equi ist ein weltweit verbreiteter Infektionserreger und einer der wichtigsten Ursachen für die Erkrankung von ein bis sechs Monate alten Fohlen. Die Erkrankung ist vornehmlich durch eitrige Bronchopneumonien mit ausgedehnter Abszessbildung charakterisiert. In seltenen Fällen kann es auch zu einer Manifestation im Verdauungstrakt kommen, die durch eine Enteritis und einer mesenterialen Lymphadenopathie gekennzeichnet ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Nachweis von Rhodococcus equi aus Nasentupfern und Tracheobronchialsekret von Fohlen mit abszedierenden Bronchopneumonien mit Hilfe einer PCR zu ermöglichen. Bereits beschriebene PCR-Verfahren wurden auf ihre Eignung für die Diagnostik überprüft und adaptiert. Die Spezifität der jeweiligen PCR wurde anhand von 20 differentialdiagnostisch relevanten Bakterienspezies überprüft. Die Ergebnisse der PCRs wurden den Ergebnissen der klinischen wie auch der kulturellen Untersuchung gegenübergestellt. Dabei wurde das jeweilige Probenmaterial berücksichtigt. 123 Isolate und insgesamt 158 Tupferproben aus den Atemwegen wurden als Untersuchungsmaterial eingesetzt. Die bereits beschriebene 16S-PCR eignete sich nur zur Speziesidentifizierung von Isolaten und die VapA-PCR lediglich zum Nachweis Virulenzplasmid-tragender Rhodokokken. Beschriebene Sequenzen der ChoE-PCR auf der Basis der Cholesteroloxidase ergaben in der Sequenzdatenbankanalyse große Homologien zum Brevibacterium sterolicum und Streptomyces coelicolor und waren somit für die Routinediagnostik nicht geeignet. Von den PCRs auf chromosomaler Ebene zeichneten sich hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität mit der IupA-PCR, der IdeR500-PCR und mit der AceA500-PCR die besten Ergebnisse gegenüber der klinischen wie auch der kulturellen Untersuchung insbesondere an Tracheobronchialsekret-Tupfern und an mediumhaltigen Nasentupfern ab. Letztendlich zeigte sich an den Ergebnissen, dass die beste Sensitivität und Spezifität durch eine Kombination der IupA-PCR mit der IdeR500-PCR oder der AceA500-PCR in Form einer Duplex-PCR oder in parallelen Einzel-PCRs erzielt wird und somit diese PCRs gut in der Routinediagnostik in Form von Screening-Untersuchungen einsetzbar sind. Im Weiteren sollte jedoch an einer Optimierung der DNA-Präparation und gegebenenfalls an einer Anreicherung des Erregers gearbeitet werden um die Sensitivität der jeweiligen PCRs zu erhöhen.

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Lorenz, Nicole: Etablierung und Validierung einer PCR in der Routinediagnostik zum Nachweis von Rhodococcus equi in Untersuchungsmaterial aus dem Atemtrakt von Fohlen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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