Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung der Isolierung, selektiven Anreicherung und Transfektion adulter Schwann-Zellen der Ratte und des Menschen zur Überexpression von FGF-2-Isoformen

Mauritz, Christina

Concerning the development of alternative therapies to restore peripheral nerves the use of transplanted Schwann cells genetically modified (transfected) to overexpress fibroblast growth factor-2 (FGF-2) isoforms is a very promising approach. Schwann cells as well as FGF-2 play a crucial role in the endogenous regeneration process following peripheral nerve injury. Among other things Schwann cells are a cellular source of FGF-2. Transfection of Schwann cells using the appropriate plasmids can enforce the endogenous production of FGF-2 isoforms. The regeneration promoting qualities of Schwann cells and neurotrophic factors, like FGF-2, are thereby combined. Schwann cells obtained from newborn rats, which were transfected to overexpress the high molecular weight 21 and 23 kDa-FGF-2 isoforms, enhanced peripheral nerve regeneration across long gaps after transplantation into the axotomized sciatic nerve of adult rats. Due to the fact that mostly young adults are affected by brachial plexus lesions after motorcycle accidents , it is necessary to obtain Schwann cells from adults (adult Schwann cells), and to cultivate and transfect them in sufficient amounts. Because for a clinical application transplanted Schwann cells should be autologous to avoid immune rejection. Therefore, Schwann cells should be isolated from the patient's own peripheral nerve biopsy. These autologous cells could be reimplanted at the site of injury after enrichment, transfection and expansion. For that particular purpose first experiments were conducted with Schwann cells of adult rats. The gained experience was applied to culture adult human Schwann cells. In the literature several methods are described to isolate adult Schwann cells from peripheral nerve tissue. These methods were compared, modified and that, which resulted in highest cell yields, was chosen for further experiments. In vivo as well as in vitro predegeneration of adult peripheral nerves inducing Wallerian degeneration is an effective method to obtain high numbers of activated Schwann cells. 10-12 days of in vivo predegeneration of adult rat sciatic nerves resulted in 1.1 x 105 living cells/mg tissue and analogous 14 days of in vitro predegeneration of adult human peripheral nerve material resulted in 0.3 x 105 living cells/mg tissue. Growth of contaminating fibroblasts was inhibited by using selective culture conditions. Furthermore, Cold jet was established as an easy and fast method to enrich adult Schwann cells. Using this enrichment procedure the percentage of Schwann cells in cultures could be elevated to > 90 %. In addition high proliferation rates (adult rat Schwann cells: > 40 %, adult human Schwann cells: > 30 %) were achieved by the application of specific mitogens during cultivation. Electroporation, as a physical method to modify cells genetically, was established to transfect adult Schwann cells in an effective, fast and well reproducible way. Electroporation is therefore a suitable alternative to the already published virus-mediated transduction of adult Schwann cells, which is associated with safety risks. In this study up to 19 % of adult rat and up to 34 % of adult human Schwann cells were successfully transfected using electroporation. Another attempt was to shorten the cultivation time in view of an early reimplantation of transfected (autologous) adult Schwann cells, and therefore, the in vitro predegeneration period was reduced to 7 days. Hereby obtained cultures exhibited up to 48.4 % green-fluorescent (expression of enhanced green fluorescent protein) adult human Schwann cells after electroporation indicating an enhanced transfection rate. This approach should be pursued. The successful transfection of adult human Schwann cells with FGF-2 was shown by the expression of a Discosoma red fluorescent protein marked 18 kDa-FGF-2 isoform. The present work provides reproducible conditions, which are a proper base for further investigations with Schwann cells of adult rats and humans.

Im Rahmen der Entwicklung alternativer Therapien zur Wiederherstellung peripherer Nerven stellen genetisch veränderte (transfizierte) Schwann-Zellen, welche Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2)-Isoformen überexprimieren, einen vielversprechenden Ansatz dar. Sowohl Schwann-Zellen als auch FGF-2 spielen in der Unterstützung körpereigener Regenerationsprozesse nach peripherer Nervenverletzung eine wichtige Rolle. Schwann-Zellen bilden dabei unter anderem eine natürliche Quelle für FGF-2. Durch die Transfektion der Schwann-Zellen mit entsprechenden Plasmiden kann die endogene Produktion der FGF-2-Isoformen gesteigert und so die regenerationsfördernden Eigenschaften von Schwann-Zellen mit denen eines neurotrophen Faktors (FGF-2) kombiniert werden. Schwann-Zellen neonataler Ratten, welche die höhermolekularen 21 und 23 kDa-FGF-2-Isoformen überexprimierten und innerhalb artifiziell hergestellter Nerveninterponate zwischen die Stümpfe des axotomierten Nervus ischiadicus adulter Ratten transplantiert wurden, unterstützten die Regeneration großer Defektstrecken peripherer Nerven. Aufgrund der Tatsache, dass gerade bei Läsionen des Armnervengeflechtes (Plexus brachialis) sehr häufig junge Erwachsene nach Motorradunfällen betroffen sind, ist die Notwendigkeit gegeben, auch Schwann-Zellen von Erwachsenen (adulte Schwann-Zellen) in ausreichender Menge kultivieren und transfizieren zu können. Denn die Schwann-Zellen sollten bei einem späteren klinischen Einsatz autolog sein, um Abstoßungsreaktionen zu verhindern. Das heißt, sie sollten aus dem Gewebe des betroffenen Patienten gewonnen (periphere Nervenbiopsie) und nach Anreicherung, Transfektion und Vermehrung in Kultur reimplantiert werden. Um dies zu erreichen wurden erste Versuche an Schwann-Zellen der adulten Ratte durchgeführt und die so gewonnenen Erfahrungen auf adulte humane Schwann-Zellen übertragen. In der Literatur beschriebene Verfahren zur Isolierung adulter Schwann-Zellen aus peripherem Nervengewebe wurden in der vorliegenden Arbeit miteinander verglichen, modifiziert und die Methode, welche zur höchsten Zellausbeute führte, wurde für die Gewinnung adulter Schwann-Zellen in der eigenen Arbeit etabliert. Die Prädegeneration adulter peripherer Nerven, das heißt die Induktion der in vivo oder der entsprechend in vitro ablaufenden Waller-Degeneration, in deren Verlauf adulte differenzierte Schwann-Zellen dedifferenzieren und mitotisch angeregt werden, erzielte die besten Ergebnisse. So konnten durch eine 10-12-tägige in vivo-Prädegeneration der Nervi ischiadici adulter Ratten ca. 1,1 x 105 vitale Zellen/mg Nervengewebe und durch die analoge Methode der 14-tägigen in vitro-Prädegeneration humanen peripheren Nervengewebes bis zu 0,3 x 105 vitale Zellen/mg Nervengewebe gewonnen werden. Kontaminierende Fibroblasten konnten durch selektive Kulturbedingungen in ihrem Wachstum gehemmt werden. Außerdem wurde mit Cold jet erstmalig eine einfache und schnelle Methode zur aktiven Anreicherung adulter Schwann-Zellen etabliert. Der Anteil adulter Schwann-Zellen in den Kulturen konnte so auf über 90 % angehoben werden. Es ist zudem durch die Applikation spezifischer Mitogene gelungen, erwünscht hohe Proliferationsraten adulter Schwann-Zellen (Ratten-Schwann-Zellen: > 40 %, humane Schwann-Zellen: > 30 %) während der Kultivierung zu erzielen. Mit der Elektroporation, einer physikalischen Methode zur genetischen Veränderung von Zellen, konnte eine effiziente, schnelle und gut reproduzierbare Alternative zur bisher publizierten risikobehafteten Virus-vermittelten Transduktion adulter Schwann-Zellen etabliert werden. Es wurden Transfektionsraten von bis zu 19 % bei adulten Ratten-Schwann-Zellen und bis zu 34 % bei adulten humanen Schwann-Zellen erreicht. Das Augenmerk lag außerdem auf einer möglichen Verkürzung der Kultivierungsphase zur schnellstmöglichen Reimplantation transfizierter (autologer) adulter Schwann-Zellen. Hierzu wurde die zunächst auf 14 Tage ausgerichtete in vitro-Prädegeneration des humanen Nervenmaterials auf 7 Tage verkürzt. Die so gewonnenen Kulturen wiesen nach der Elektroporation mit bis zu 48,4 % grün-fluoreszierenden (Expression des Markerproteins Enhanced Green Fluorescent Protein) adulten humanen Schwann-Zellen außerdem eine gesteigerte Transfektionsrate auf. Dieser Ansatz sollte deshalb weiter verfolgt werden. Die erfolgreiche Transfektion adulter humaner Schwann-Zellen mit FGF-2 konnte durch die Expression einer mit Discosoma Red Fluorescent Protein-markierten 18 kDa-FGF-2-Isoform bewiesen werden. Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, unter Verwendung eines serumfreien Mediums, definierbare und reproduzierbare Bedingungen zu schaffen, welche eine gute Grundlage für alle weiterführenden Untersuchungen mit adulten Schwann-Zellen der Ratte und des Menschen darstellen.

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Mauritz, Christina: Etablierung der Isolierung, selektiven Anreicherung und Transfektion adulter Schwann-Zellen der Ratte und des Menschen zur Überexpression von FGF-2-Isoformen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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