Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studies on the interaction of chromatin-unstable boar sperm with the female reproductive tract

Ardón Martinez, Florencia

The aim of this study was to elucidate the relevance of sperm chromatin instability for the fertilization capacity of boar semen. This was achieved using in vitro and in vivo models to analyze the interaction of chromatin unstable sperm with the female reproductive tract. Chromatin instability is generally believed to be one of the main causes of embryonic mortality and it is presumed that there is no specific selection for chromatin stability in the female reproductive tract. Thus, sperm with unstable chromatin structure might be able to fertilize the oocyte, but not to sustain embryonic development, thereby causing early embryonic death. In this study, the semen of 173 boars from a commercial boar stud was evaluated. It was found that a relatively low percentage (14.5%) of them had high rates of chromatin instability in their ejaculates and that few of them (4%) showed this problem chronically. Chromatin instability was correlated significantly (r=0.44, P=0.01) with the percentage of sperm with plasma droplets. Two studies were done to determine whether chromatin stability is part of the selection criteria in the reproductive tract. First, the chromatin structure of diluted boar sperm was compared to that of Percoll®-treated sperm and of sperm released from oviductal epithelia in vitro. Sperm were treated with Percoll® gradient centrifugation to eliminate seminal plasma and extender. Then, Percoll®-treated sperm (n=14 ejaculates from four boars) were co-incubated with oviductal epithelia (n = 2 sows per boar) for 30 min in a 5% CO2, 39 °C, atmosphere. Sperm were released from the oviduct through snap-freezing in liquid nitrogen. Chromatin stability was evaluated using the modified fluorescent microscopic Sperm Chromatin Structure Assay (mfSCSA). Sperm released from the oviduct had significantly fewer (P<0.05) sperm with unstable chromatin than Percoll®-treated or diluted sperm. Percoll®-treated sperm showed significantly fewer (P<0.05) sperm with unstable chromatin in two boars. A second experiment was performed to determine whether, and to what extent, sperm with unstable chromatin could reach and penetrate the zona pellucida of oocytes in vivo. Accessory sperm are those found in the zona pellucida, thus considered competent for fertilization. The diluted semen of two donor boars had elevated percentages of sperm with unstable chromatin (more than 5%); a third boar was used as a control. 14 gilts were inseminated up to three times with 2 x 109 sperm diluted in BTS. The gilts were evaluated every 12 h to determine estrus and ovulation. 3 to 5 days after ovulation, the gilts were slaughtered and their reproductive tracts flushed for embryo recovery. The morphology of the embryos was evaluated under a stereomicroscope. The chromatin stability of the sperm used for insemination and of the accessory sperm found in the zona pellucida of the embryos was evaluated using the mfSCSA. In both boars with more than 5% chromatin instability, accessory sperm had significantly lower (P<0.05) percentages of chromatin instability than the sperm that were used for insemination. A further goal of this study was to assess the value of quantitative analysis of accessory sperm for use in the study of the effect of chromatin disturbance and other sperm defects on fertilization capacity. 96 gilts were each inseminated with max. 30 h stored semen from one of three boars. Ovulation was detected in 12 h intervals using transcutaneous sonography. Embryos were recovered 3 to 5 d after ovulation. Neither the artificial insemination to ovulation interval nor the boar exerted an effect on the fertilization rates of normal embryos. The boar had a significant effect on accessory sperm numbers. There was a significant relationship between accessory sperm count and litter quality. Embryos from litters with a 100% fertilization rate (normal embryos only) had significantly higher accessory sperm counts than normal embryos from litters where either embryonic degeneration or partial fertilization was also present. The results of these studies show that sperm with stable chromatin are more likely both to bind to the oviduct in vitro and to traverse the reproductive tract in vivo, ultimately reaching the oocytes and penetrating the zona pellucida. This might be caused by the association of chromatin instability with plasma membrane changes, which prevent the binding of the sperm to the oviductal epithelia. Additionally, chromatin instability might be related to other defects, which might hinder the passage of chromatin-unstable sperm into the oviducts. Based on these results, it is suggested that sperm with unstable chromatin have lower probabilities of fertilizing oocytes than chromatin-stable sperm. This study, however, was not intended to determine the actual impact of chromatin instability on boar fertility. To evaluate effectively the fertilization capacity of semen, based on chromatin instability, it would be advisable to use the Hannover Gilt Model, which uses fertilization rate, the rate of normal embryos and accessory sperm counts as tools to evaluate semen quality. In this study, accessory sperm counts were proven a valuable tool for the evaluation of fertilization capacity of semen samples.

Das Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von Spermienchromatin-Instabilität für die Befruchtungskapazität von Ebersamen zu untersuchen. Es wurden in vitro- und in vivo- Modelle verwendet, um die Interaktion von chromatin-instabilen Spermien mit dem weiblichen Genitaltrakt zu erforschen. Chromatin-Instabilität wird allgemein als eine der Hauptursachen für embryonale Mortalität angesehen und es wird angenommen, dass keine spezifischen Selektionsmechanismen für Chromatinstabilität im weiblichen Genitale existieren. Somit könnte ein Spermium mit instabiler Chromatinstruktur die Eizelle zwar befruchten, aber nicht die embryonale Entwicklung aufrechterhalten, wodurch es zum Tod des Embryos käme. In dieser Studie wurde Sperma von 173 Ebern einer kommerziellen Besamungsstation untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass ein relativ geringer Prozentsatz (14,5 %) der Eber hohe Werte an Chromatin-Instabilität aufwiesen und dass einige davon (4 %) dieses Problem chronisch zeigten. Chromatin-Instabilität war signifikant korreliert (r=0,44; P=0,01) mit dem Prozentsatz an Plasmatropfen. Es wurden zwei Studien durchgeführt, um zu analysieren, ob die Chromatin-Stabilität Teil der Selektionskriterien im weiblichen Geschlechtstrakt ist. Zuerst wurde die Chromatinstruktur von verdünnten Eberspermien mit der von Percoll-behandelten Spermien und von oviduktgebundenen Spermien in vitro verglichen. Die Spermien wurden durch Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Seminalplasma und Verdünner befreit. Dann wurden die Percoll-behandelten Spermien (n=14 Ejakulate von 4 Ebern) für 30 min in einem 39 °C warmen 5 % CO2-haltigen Milieu mit Eileiterepithel (n=2 Sauen pro Eber) inkubiert. Die Spermien wurden durch Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff vom Eileiter abgelöst. Dann wurde die Chromatinstabilität mittels modifiziertem floureszensmikroskopischem Spermienchromatinstrukur-Assay (mfSCSA) untersucht. Bei den vom Eileiter freigesetzten Spermien gab es signifikant weniger (P<0.05) chromatin-instabile Spermien als beim Percoll-behandelten oder verdünnten Sperma. Percoll-behandeltes Sperma von zwei Ebern wies signifikant weniger (P<0.05)  Spermien mit instabilem Chromatin auf. Es wurde eine zweite Studie durchgeführt, um zu untersuchen, ob und bis zu welchem Grad die chromatin-unstabilen Spermien die Zona pellucida der Eizellen in vivo erreichen und durchdringen können. Akzessorische Spermien sind diejenigen, die in der Zona pellucida gefunden werden und somit als befruchtungskompetent angesehen werden. Der verdünnte Samen von zwei Ebern wies erhöhte Prozentzahlen an Spermien mit instabilem Chromatin auf (mehr als 5 %); ein dritter Eber diente als Kontrolle. 14 Jungsauen wurden bis zu dreimal mit 2 Milliarden Spermien, verdünnt in BTS, besamt. Die Jungsauen wurden alle 12 Stunden untersucht, um Östrusbeginn und Ovulationszeitpunkt zu bestimmen. Drei bis fünf Tage nach der Ovulation wurden die Jungsauen geschlachtet und der Genitaltrakt zur Embryonengewinnung gespült. Die Morphologie der Embryonen wurde unter dem Stereomikroskop untersucht. Die Chromatinstabilität der Spermien, die für die Besamung verwendet wurden und die der akzessorischen Spermien, die sich in der Zona pellucida befanden, wurde mittels mfSCSA analysiert. Bei den beiden Ebern mit mehr als 5 % Chromatin-Instabilität zeigten die akzessorischen Spermien signifikant geringere (p<0,05) Prozentsätze an Chromatin-Instabilität als das für die Besamung verwendete Sperma. Ein weiteres Ziel dieser Studie bestand darin, zu prüfen, ob die quantitative Analyse von akzessorischen Spermien zur Untersuchung der Auswirkung von Chromatinstörungen oder anderen Spermiendefekten auf die Befruchtungskapazität aussagekräftig ist. 96 Jungsauen wurden jeweils mit maximal 30 h lang gelagertem Samen eines Ebers von drei Ebern besamt. Die Ovulation wurde in 12 h-Intervallen mittels transkutaner Sonographie bestimmt. Die Embryonen wurden 3 bis 5 Tage nach Ovulation gewonnen. Weder das Intervall von künstlicher Besamung bis Ovulation noch der Eber übten einen Effekt auf die Befruchtungsrate von normalen Embryos aus. Der Eber bewirkte einen deutlichen Einfluss auf die Anzahl der akzessorischen Spermien. Es zeigte sich eine signifikante Beziehung zwischen der Zahl der akzessorischen Spermien und der Wurfqualität. Embryonen von Würfen mit einer 100 %igen Befruchtungsrate (ausschließlich normale Embryos) hatten signifikant höhere Zahlen von akzessorischen Spermien als normale Embryonen aus Würfen, in denen auch embryonale Degeneration oder partielle Befruchtung vorkamen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass Spermien mit stabilem Chromatin eher fähig sind, sowohl in vitro ans Ovidukt zu binden als auch in vivo den Genitaltrakt zu passieren, letztlich die Eizellen zu erreichen und die Zona pellucida zu durchdringen. Die Ursache dafür könnte sein, dass Chromatin-Instabilität assoziiert ist mit Plasmamembran-Veränderungen, die eine Bindung der Spermien an das Oviduktepithel verhindern. Zusätzlich könnte Chromatin-Instabilität mit anderen Defekten einhergehen, die die Passage von chromatin-instabilen Spermien in die Eileiter behindern. Aufgrund dieser Ergebnisse kann man vermuten, dass Spermien mit instabilem Chromatin geringere Wahrscheinlichkeiten haben Eizellen zu befruchten als chromatinstabile Spermien. Diese Studie hatte nicht zum Ziel, den direkten Einfluss von Chromatin-Instabilität auf die Eberfertilität zu bestimmen. Um die Befruchtungskapazität von Sperma auf der Basis von Chromatin-Instabilität genauestens zu untersuchen, wäre die Verwendung des Hannover Gilt Models anzuraten, welches die Befruchtungsrate, die Anzahl normaler Embryos und die Anzahl akzessorischer Spermien als Bewertungsmaßstäbe für die Samenqualität einbezieht. In dieser Studie wurde belegt, dass die Anzahl akzessorischer Spermien ein wertvoller Parameter für die Beurteilung der Befruchtungskapazität von Spermaproben ist.

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Ardón Martinez, Florencia: Studies on the interaction of chromatin-unstable boar sperm with the female reproductive tract. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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