Studies on the interaction of chromatin-unstable boar sperm with the female reproductive tract

Das Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von Spermienchromatin-Instabilität für die Befruchtungskapazität von Ebersamen zu untersuchen. Es wurden in vitro- und in vivo- Modelle verwendet, um die Interaktion von chromatin-instabilen Spermien mit dem weiblichen Genitaltrakt zu erforschen. Chromatin-Instabilität wird allgemein als eine der Hauptursachen für embryonale Mortalität angesehen und es wird angenommen, dass keine spezifischen Selektionsmechanismen für Chromatinstabilität im weiblichen Genitale existieren. Somit könnte ein Spermium mit instabiler Chromatinstruktur die Eizelle zwar befruchten, aber nicht die embryonale Entwicklung aufrechterhalten, wodurch es zum Tod des Embryos käme. In dieser Studie wurde Sperma von 173 Ebern einer kommerziellen Besamungsstation untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass ein relativ geringer Prozentsatz (14,5 %) der Eber hohe Werte an Chromatin-Instabilität aufwiesen und dass einige davon (4 %) dieses Problem chronisch zeigten. Chromatin-Instabilität war signifikant korreliert (r=0,44; P=0,01) mit dem Prozentsatz an Plasmatropfen. Es wurden zwei Studien durchgeführt, um zu analysieren, ob die Chromatin-Stabilität Teil der Selektionskriterien im weiblichen Geschlechtstrakt ist. Zuerst wurde die Chromatinstruktur von verdünnten Eberspermien mit der von Percoll-behandelten Spermien und von oviduktgebundenen Spermien in vitro verglichen. Die Spermien wurden durch Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Seminalplasma und Verdünner befreit. Dann wurden die Percoll-behandelten Spermien (n=14 Ejakulate von 4 Ebern) für 30 min in einem 39 °C warmen 5 % CO2-haltigen Milieu mit Eileiterepithel (n=2 Sauen pro Eber) inkubiert. Die Spermien wurden durch Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff vom Eileiter abgelöst. Dann wurde die Chromatinstabilität mittels modifiziertem floureszensmikroskopischem Spermienchromatinstrukur-Assay (mfSCSA) untersucht. Bei den vom Eileiter freigesetzten Spermien gab es signifikant weniger (P<0.05) chromatin-instabile Spermien als beim Percoll-behandelten oder verdünnten Sperma. Percoll-behandeltes Sperma von zwei Ebern wies signifikant weniger (P<0.05)  Spermien mit instabilem Chromatin auf. Es wurde eine zweite Studie durchgeführt, um zu untersuchen, ob und bis zu welchem Grad die chromatin-unstabilen Spermien die Zona pellucida der Eizellen in vivo erreichen und durchdringen können. Akzessorische Spermien sind diejenigen, die in der Zona pellucida gefunden werden und somit als befruchtungskompetent angesehen werden. Der verdünnte Samen von zwei Ebern wies erhöhte Prozentzahlen an Spermien mit instabilem Chromatin auf (mehr als 5 %); ein dritter Eber diente als Kontrolle. 14 Jungsauen wurden bis zu dreimal mit 2 Milliarden Spermien, verdünnt in BTS, besamt. Die Jungsauen wurden alle 12 Stunden untersucht, um Östrusbeginn und Ovulationszeitpunkt zu bestimmen. Drei bis fünf Tage nach der Ovulation wurden die Jungsauen geschlachtet und der Genitaltrakt zur Embryonengewinnung gespült. Die Morphologie der Embryonen wurde unter dem Stereomikroskop untersucht. Die Chromatinstabilität der Spermien, die für die Besamung verwendet wurden und die der akzessorischen Spermien, die sich in der Zona pellucida befanden, wurde mittels mfSCSA analysiert. Bei den beiden Ebern mit mehr als 5 % Chromatin-Instabilität zeigten die akzessorischen Spermien signifikant geringere (p<0,05) Prozentsätze an Chromatin-Instabilität als das für die Besamung verwendete Sperma. Ein weiteres Ziel dieser Studie bestand darin, zu prüfen, ob die quantitative Analyse von akzessorischen Spermien zur Untersuchung der Auswirkung von Chromatinstörungen oder anderen Spermiendefekten auf die Befruchtungskapazität aussagekräftig ist. 96 Jungsauen wurden jeweils mit maximal 30 h lang gelagertem Samen eines Ebers von drei Ebern besamt. Die Ovulation wurde in 12 h-Intervallen mittels transkutaner Sonographie bestimmt. Die Embryonen wurden 3 bis 5 Tage nach Ovulation gewonnen. Weder das Intervall von künstlicher Besamung bis Ovulation noch der Eber übten einen Effekt auf die Befruchtungsrate von normalen Embryos aus. Der Eber bewirkte einen deutlichen Einfluss auf die Anzahl der akzessorischen Spermien. Es zeigte sich eine signifikante Beziehung zwischen der Zahl der akzessorischen Spermien und der Wurfqualität. Embryonen von Würfen mit einer 100 %igen Befruchtungsrate (ausschließlich normale Embryos) hatten signifikant höhere Zahlen von akzessorischen Spermien als normale Embryonen aus Würfen, in denen auch embryonale Degeneration oder partielle Befruchtung vorkamen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass Spermien mit stabilem Chromatin eher fähig sind, sowohl in vitro ans Ovidukt zu binden als auch in vivo den Genitaltrakt zu passieren, letztlich die Eizellen zu erreichen und die Zona pellucida zu durchdringen. Die Ursache dafür könnte sein, dass Chromatin-Instabilität assoziiert ist mit Plasmamembran-Veränderungen, die eine Bindung der Spermien an das Oviduktepithel verhindern. Zusätzlich könnte Chromatin-Instabilität mit anderen Defekten einhergehen, die die Passage von chromatin-instabilen Spermien in die Eileiter behindern. Aufgrund dieser Ergebnisse kann man vermuten, dass Spermien mit instabilem Chromatin geringere Wahrscheinlichkeiten haben Eizellen zu befruchten als chromatinstabile Spermien. Diese Studie hatte nicht zum Ziel, den direkten Einfluss von Chromatin-Instabilität auf die Eberfertilität zu bestimmen. Um die Befruchtungskapazität von Sperma auf der Basis von Chromatin-Instabilität genauestens zu untersuchen, wäre die Verwendung des Hannover Gilt Models anzuraten, welches die Befruchtungsrate, die Anzahl normaler Embryos und die Anzahl akzessorischer Spermien als Bewertungsmaßstäbe für die Samenqualität einbezieht. In dieser Studie wurde belegt, dass die Anzahl akzessorischer Spermien ein wertvoller Parameter für die Beurteilung der Befruchtungskapazität von Spermaproben ist.