Molecular mechanisms of the adaptation of Actinobacillus pleuropneumoniae to the porcine respiratory tract

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der porcinen Pleuropneumonie, einer weltweit verbreiteten Erkrankung von großer ökonomischer Bedeutung. Die Krankheit ist durch hämorrhagische Lungenveränderungen, Nekrosen und fibrinös-fibrosierende Pleuritis gekennzeichnet. Von besonderer epidemiologischer Bedeutung ist die Fähigkeit des Erregers, auf der Oberfläche der Lungenepithelien, in den Tonsillen und in dem anaeroben Milieu der Lungensequester zu überleben und somit in chronisch infizierten, klinisch unauffälligen Tieren zu persistieren. In dieser Arbeit wurde eine Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese und Quadrupole-Massenspektrometrie eingesetzt, um Proteine von A. pleuropneumoniae zu identifizieren, die in einem ex vivo Modell durch die Zugabe bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) induziert wurden. Ein durch BALF-Zusatz vermehrt exprimierter, potentieller virulenzassoziierter Faktor, eine Aspartat Ammonia-Lyase (Aspartase), wurde charakterisiert. Das Enzym katalysiert die Produktion von Fumarat, das unter anaeroben Bedingungen als alternativer Elektronenakzeptor fungieren kann. In einer früheren Arbeit konnte gezeigt werden, dass Mutanten mit einer Deletion in der DMSO Reduktase (DmsA), die ebenfalls zur anaeroben Respiration beiträgt, in der akuten Phase der Erkrankung attenuiert sind. Das die Aspartase kodierende Gen aspA ist in allen A. pleuropneumoniae Serotypen vorhanden. Stromaufwärts des identifizierten Transkriptionsstartpunktes liegt eine mögliche Bindungsstelle für den anaeroben Regulator FNR (HlyX) und mittels einer HlyX-Mutante konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Aspartaseaktivität unter anaeroben Bedingungen tatsächlich HlyX-abhängig ist. Die BALF-abhängige Aktivierung der aspA Transkription konnte mittels einer isogenen Mutante, die eine chromosomal lokalisierte transkriptionelle aspA::luxAB Fusion trägt, bestätigt werden. Zwei Aspartase-defiziente Deletionsmutanten, A. pleuropneumoniae ∆aspA und A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA, wurden konstruiert; beide zeigten in vitro vermindertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen. Schweine, die in einem Aerosolmodell mit einer der beiden Mutanten belastet wurden, wiesen ein geringeres Maß an Lungenveränderungen auf als Tiere der Kontrollgruppe, die mit dem Wildtyp infiziert wurden. Zudem zeigten Tiere, die mit A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA infiziert wurden, signifikant weniger klinische Symptome als die Kontrollgruppe. Die Reisolierung von A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA aus unveränderter Lunge gelang nur sporadisch und in geringer Anzahl, wohingegen der Wildtyp und A. pleuropneumoniae ∆aspA regelmäßig und in hoher Zahl nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Enzyme, die an der anaeroben Atmung beteiligt sind, notwendig für die Persistenz des Erregers auf dem respiratorischen Epithelium sind und eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielen könnten. In einer früheren Studie (HENNIG et al. 1999) konnte gezeigt werden, dass die Expression Eisenmangel-regulierter Proteine, wie die des für die Infektion essentiellen TbpB-Proteins, durch Zusatz von BALF induziert wird. Von anderen bakteriellen Spezies ist bekannt, dass die Regulation eisenabhängig transkribierter Gene durch den globalen Regulators Fur („ferric uptake regulator“) vermittelt wird. Um die potentielle Bedeutung von Fur für die BALF-induzierte Proteinexpression von A. pleuropneumoniae zu untersuchen, wurde eine isogene Deletionsmutante A. pleuropneumoniae ∆fur konstruiert. Unter Verwendung dieser Mutante konnte gezeigt werden, dass die zuvor beschriebene BALF-induzierte Expression der Transferrin-bindenden Proteine tatsächlich durch Fur vermittelt wird. Ferner zeigte die Mutante deutliche Wachstumsdefizite unter aeroben und anaeroben Bedingungen auf PPLO-Agarplatten und in Flüssigmedium und war nicht in der Lage, auf Bacitracin-haltigem Selektivagar zu wachsen. Da dieses Phänomen durch die Zugabe eines Eisenchelators aufgehoben werden konnte, scheint die bei der Mutante festgestellte Bacitracinempfindlichkeit eisenabhängig zu sein. Die Prüfung von A. pleuropneumoniae ∆fur im Aerosolinfektionsmodel ergab, dass die Mutante zwar regelmäßig klinische Erkrankungen und Lungenveränderungen verursachte, aber signifikant attenuiert war. Dies unterstreicht die Bedeutung der Fur abhängigen Genregulation für A. pleuropneumoniae. Um weitere BALF-induzierte und potentiell durch Fur regulierte Proteine zu identifizieren, wurde eine vergleichende Proteomanalyse oberflächenassoziierter Proteine von A. pleuropneumoniae nach Anzucht unter Standardbedingungen und Induktion mit BALF sowie A. pleuropneumoniae ∆fur durchgeführt. Fünf der zwölf durch BALF induzierbaren Proteine waren auch in A. pleuropneumoniae ∆fur hochreguliert. Vier der fünf Proteine konnten mittels Massenspektrometrie identifiziert werden: Es handelte sich um das Hitzeschockprotein GroES, um Bindeproteine für einen Dipeptidtransporter und einen Metallionentransporter sowie um ein konserviertes Protein unbekannter Funktion. Die Gene der beiden letztgenannten Proteine weisen mögliche Fur-Bindungstellen auf. Da die Supplementierung der BALF mit Eisen keinen Einfluß auf die Expression dieser Proteine hatte, ist es wahrscheinlich, dass wirtsspezifische Faktoren und nicht Eisenmangel zu der verstärkten Expression Fur-regulierter Proteine in BALF-induzierten Kulturen führen. Von den weiteren, nur durch BALF induzierten Proteinen konnten vier identifiziert werden, es handelt sich dabei unter anderem um ein mRNA-stabilisierendes Protein, für das in einer anderen Studie gezeigt wurde, dass es bedeutsam für das Überleben des Erregers im Wirt ist. Diese Studie zeigt somit, dass die differentielle Proteomanalyse, ergänzend zu Studien des Transkriptoms, eine wertvolle Methode darstellt, um molekulare Mechanismen zu identifizieren, die der Adaptation des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen dienen. Unter Verwendung eines ex vivo Models wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um virulenzassoziierte Proteine von A. pleuropneumoniae zu identifizieren. Da sowohl HlyX- als auch Fur- regulierte Proteine identifiziert wurden, erscheint es sinnvoll, die Fur- und HlyX-Regulons in der Zukunft genauer zu charakterisieren. Die Proteomanalyse von entsprechenden Mutanten, A. pleuropneumoniae ∆fur und A. pleuropneumoniae ∆hlyX, könnte sich dabei als nützlich erweisen und unser Verständnis der Mechanismen, die A. pleuropneumoniae das Überleben im Wirt ermöglichen, grundlegend erweitern.