Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular mechanisms of the adaptation of Actinobacillus pleuropneumoniae to the porcine respiratory tract

Jacobsen, Ilse D.

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the etiological agent of porcine pleuropneumonia, a disease of economic importance occurring worldwide. The disease is characterized by hemorrhagic and necrotizing lung lesions in combination with a fibrinous to fibrous pleuritis. The pathogen’s ability to survive on respiratory epithelia, in tonsils, and in the anaerobic environment of encapsulated sequesters is of epidemiological importance, as it leads to clinically healthy carrier animals. In the present study two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was used in combination with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to identify A. pleuropneumoniae proteins upregulated in an ex vivo model upon induction with bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Among these proteins, the aspartate ammonia-lyase (aspartase) was further characterized. This enzyme is involved in the production of fumarate, an alternative electron acceptor under anaerobic conditions. It has been previously demonstrated that deletion of the anaerobic DMSO reductase gene (dmsA), likewise involved in anaerobic respiration, results in attenuation in acute disease. The gene coding for aspartase, aspA was cloned and shown to be present in all A. pleuropneumoniae serotype reference strains. The transcriptional start point was identified downstream of a putative FNR (HlyX) binding motif, and HlyX-dependency of aspartase upregulation under anaerobic conditions was confirmed using an HlyX-mutant. BALF-dependent activation of aspA was confirmed by construction of an isogenic A. pleuropneumoniae mutant carrying a chromosomal aspA::luxAB transcriptional fusion. Two aspA deletion mutants, A. pleuropneumoniae ∆aspA and A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA were constructed, both showing reduced growth under anaerobic conditions in vitro. Pigs challenged with either of the two mutants in an aerosol infection model showed a lower lung lesion score compared to the A. pleuropneumoniae wild type (wt) controls. Pigs challenged with A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA had a significantly lower clinical score, and this mutant was rarely reisolated from unaltered lung tissue; in contrast, A. pleuropneumoniae ∆aspA and A. pleuropneumoniae wt were consistently reisolated in high numbers. These results suggest, that enzymes involved in anaerobic respiration are necessary for the pathogen's ability to persist on respiratory tract epithelium and play an important role in A. pleuropneumoniae pathogenesis. In previous studies BALF was shown to induce expression of putatively Fur-regulated proteins (HENNIG et al. 1999) , such as TbpB, which is essential for establishment of A. pleuropneumoniae infection. The alteration of gene expression in response to iron restriction in various bacteria is known to be largely mediated by the ferric uptake regulator Fur. To further investigate the role of Fur in BALF-induced expression of A. pleuropneumoniae proteins, the isogenic in-frame deletion mutant A. pleuropneumoniae ∆fur was constructed. This mutant showed growth deficiencies on PPLO agar plates and in liquid medium under aerobic and anaerobic conditions. Further, the mutant did not grow on selective agar containing bacitracin; this effect was abolished by addition of an iron chelator to the selective agar, thereby implying that sensitivity to this antibiotic depends on iron availability. Expression of transferrin-binding proteins in A. pleuropneumoniae ∆fur was investigated, and it could be demonstrated, that iron-mediated repression of these proteins depends on Fur. To investigate virulence of A. pleuropneumoniae ∆fur, an aerosol infection experiment was performed. The mutant was found to be significantly attenuated but still able to consistently colonize and cause both clinical disease and lung lesions. This clearly demonstrates the importance of Fur-mediated gene regulation for A. pleuropneumoniae virulence. In order to identify additional BALF-induced proteins that might belong to the Fur regulon, a differential proteome analysis of surface-associated protein preparations of A. pleuropneumoniae wt grown under standard conditions and after induction with BALF were compared to A. pleuropneumoniae ∆fur. Five of the twelve proteins upregulated by BALF were also found to be upregulated in A. pleuro-pneumoniae ∆fur. Of these five proteins four could be identified by mass spectrometry as the heat shock chaperonine GroES, a binding protein for a putative dipeptide transport system, part of a putative metal ion transport system and an uncharacterized protein conserved in bacteria, respectively. Upstream of the genes coding for the later two, putative Fur boxes were identified. Iron supplementation did not influence expression of these proteins, suggesting that yet unknown factors in the BALF rather than iron deficiency are responsible for the observed upregulation of Fur-regulated proteins in BALF-induced cultures. Of the remaining proteins induced by BALF, four could be identified; one of these is involved in mRNA stabilization and has been previously reported to be important for A. pleuropneumoniae survival in the host. In summary, this study showed that differential proteome analysis can be a valuable tool to complement and extend transcriptome studies aimed at unravelling molecular mechanisms of bacterial adaptation to different environments. In combination with an ex vivo model, this approach was successfully used to identify proteins important for A. pleuropneumoniae virulence. Members of both the Fur and the HlyX regulon were found to be upregulated in the ex vivo model in this study. Future work aimed at a comprehensive analysis of both the Fur and the HlyX regulon, possibly by employing proteomic methods to A. pleuropneumoniae ∆fur and A. pleuropneumoniae ∆hlyX mutants, could significantly expand our understanding of the pathways that allow A. pleuropneumoniae to survive and persist in the host.

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der porcinen Pleuropneumonie, einer weltweit verbreiteten Erkrankung von großer ökonomischer Bedeutung. Die Krankheit ist durch hämorrhagische Lungenveränderungen, Nekrosen und fibrinös-fibrosierende Pleuritis gekennzeichnet. Von besonderer epidemiologischer Bedeutung ist die Fähigkeit des Erregers, auf der Oberfläche der Lungenepithelien, in den Tonsillen und in dem anaeroben Milieu der Lungensequester zu überleben und somit in chronisch infizierten, klinisch unauffälligen Tieren zu persistieren. In dieser Arbeit wurde eine Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese und Quadrupole-Massenspektrometrie eingesetzt, um Proteine von A. pleuropneumoniae zu identifizieren, die in einem ex vivo Modell durch die Zugabe bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) induziert wurden. Ein durch BALF-Zusatz vermehrt exprimierter, potentieller virulenzassoziierter Faktor, eine Aspartat Ammonia-Lyase (Aspartase), wurde charakterisiert. Das Enzym katalysiert die Produktion von Fumarat, das unter anaeroben Bedingungen als alternativer Elektronenakzeptor fungieren kann. In einer früheren Arbeit konnte gezeigt werden, dass Mutanten mit einer Deletion in der DMSO Reduktase (DmsA), die ebenfalls zur anaeroben Respiration beiträgt, in der akuten Phase der Erkrankung attenuiert sind. Das die Aspartase kodierende Gen aspA ist in allen A. pleuropneumoniae Serotypen vorhanden. Stromaufwärts des identifizierten Transkriptionsstartpunktes liegt eine mögliche Bindungsstelle für den anaeroben Regulator FNR (HlyX) und mittels einer HlyX-Mutante konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Aspartaseaktivität unter anaeroben Bedingungen tatsächlich HlyX-abhängig ist. Die BALF-abhängige Aktivierung der aspA Transkription konnte mittels einer isogenen Mutante, die eine chromosomal lokalisierte transkriptionelle aspA::luxAB Fusion trägt, bestätigt werden. Zwei Aspartase-defiziente Deletionsmutanten, A. pleuropneumoniae ∆aspA und A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA, wurden konstruiert; beide zeigten in vitro vermindertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen. Schweine, die in einem Aerosolmodell mit einer der beiden Mutanten belastet wurden, wiesen ein geringeres Maß an Lungenveränderungen auf als Tiere der Kontrollgruppe, die mit dem Wildtyp infiziert wurden. Zudem zeigten Tiere, die mit A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA infiziert wurden, signifikant weniger klinische Symptome als die Kontrollgruppe. Die Reisolierung von A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA aus unveränderter Lunge gelang nur sporadisch und in geringer Anzahl, wohingegen der Wildtyp und A. pleuropneumoniae ∆aspA regelmäßig und in hoher Zahl nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Enzyme, die an der anaeroben Atmung beteiligt sind, notwendig für die Persistenz des Erregers auf dem respiratorischen Epithelium sind und eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielen könnten. In einer früheren Studie (HENNIG et al. 1999) konnte gezeigt werden, dass die Expression Eisenmangel-regulierter Proteine, wie die des für die Infektion essentiellen TbpB-Proteins, durch Zusatz von BALF induziert wird. Von anderen bakteriellen Spezies ist bekannt, dass die Regulation eisenabhängig transkribierter Gene durch den globalen Regulators Fur („ferric uptake regulator“) vermittelt wird. Um die potentielle Bedeutung von Fur für die BALF-induzierte Proteinexpression von A. pleuropneumoniae zu untersuchen, wurde eine isogene Deletionsmutante A. pleuropneumoniae ∆fur konstruiert. Unter Verwendung dieser Mutante konnte gezeigt werden, dass die zuvor beschriebene BALF-induzierte Expression der Transferrin-bindenden Proteine tatsächlich durch Fur vermittelt wird. Ferner zeigte die Mutante deutliche Wachstumsdefizite unter aeroben und anaeroben Bedingungen auf PPLO-Agarplatten und in Flüssigmedium und war nicht in der Lage, auf Bacitracin-haltigem Selektivagar zu wachsen. Da dieses Phänomen durch die Zugabe eines Eisenchelators aufgehoben werden konnte, scheint die bei der Mutante festgestellte Bacitracinempfindlichkeit eisenabhängig zu sein. Die Prüfung von A. pleuropneumoniae ∆fur im Aerosolinfektionsmodel ergab, dass die Mutante zwar regelmäßig klinische Erkrankungen und Lungenveränderungen verursachte, aber signifikant attenuiert war. Dies unterstreicht die Bedeutung der Fur abhängigen Genregulation für A. pleuropneumoniae. Um weitere BALF-induzierte und potentiell durch Fur regulierte Proteine zu identifizieren, wurde eine vergleichende Proteomanalyse oberflächenassoziierter Proteine von A. pleuropneumoniae nach Anzucht unter Standardbedingungen und Induktion mit BALF sowie A. pleuropneumoniae ∆fur durchgeführt. Fünf der zwölf durch BALF induzierbaren Proteine waren auch in A. pleuropneumoniae ∆fur hochreguliert. Vier der fünf Proteine konnten mittels Massenspektrometrie identifiziert werden: Es handelte sich um das Hitzeschockprotein GroES, um Bindeproteine für einen Dipeptidtransporter und einen Metallionentransporter sowie um ein konserviertes Protein unbekannter Funktion. Die Gene der beiden letztgenannten Proteine weisen mögliche Fur-Bindungstellen auf. Da die Supplementierung der BALF mit Eisen keinen Einfluß auf die Expression dieser Proteine hatte, ist es wahrscheinlich, dass wirtsspezifische Faktoren und nicht Eisenmangel zu der verstärkten Expression Fur-regulierter Proteine in BALF-induzierten Kulturen führen. Von den weiteren, nur durch BALF induzierten Proteinen konnten vier identifiziert werden, es handelt sich dabei unter anderem um ein mRNA-stabilisierendes Protein, für das in einer anderen Studie gezeigt wurde, dass es bedeutsam für das Überleben des Erregers im Wirt ist. Diese Studie zeigt somit, dass die differentielle Proteomanalyse, ergänzend zu Studien des Transkriptoms, eine wertvolle Methode darstellt, um molekulare Mechanismen zu identifizieren, die der Adaptation des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen dienen. Unter Verwendung eines ex vivo Models wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um virulenzassoziierte Proteine von A. pleuropneumoniae zu identifizieren. Da sowohl HlyX- als auch Fur- regulierte Proteine identifiziert wurden, erscheint es sinnvoll, die Fur- und HlyX-Regulons in der Zukunft genauer zu charakterisieren. Die Proteomanalyse von entsprechenden Mutanten, A. pleuropneumoniae ∆fur und A. pleuropneumoniae ∆hlyX, könnte sich dabei als nützlich erweisen und unser Verständnis der Mechanismen, die A. pleuropneumoniae das Überleben im Wirt ermöglichen, grundlegend erweitern.

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Jacobsen, Ilse D.: Molecular mechanisms of the adaptation of Actinobacillus pleuropneumoniae to the porcine respiratory tract. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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