Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Functional characterisation of [gamma]2-herspeviral orf73 proteins and their interaction with the callular proteins BRD2 and BRD4

Ottinger, Matthias

Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) is a human pathogen of major importance mainly in the immunocompromised. The latency-associated nuclear antigen 1 (LANA-1) of KSHV, encoded by the open reading frame 73 (orf73), fulfils multiple functions vital to viral latency. However, the majority of data concerning LANA-1 function are generated in vitro. Since for example murine γ-herpesvirus 68 (MHV-68) infection of its natural mouse host could potentially provide a suitable animal model to study γ2-herpesviral orf73 functional biology in vivo, we were seeking to define functional similarities and differences of KSHV LANA-1 and homologous orf73 proteins of the related γ2-herpesviruses rhesus rhadinovirus (RRV), herpesvirus saimiri (HVS) and MHV-68. We found several KSHV LANA-1 functions that are also provided by the MHV-68 orf73 protein, such as transcriptional activation of the cell cycle dependent promoters of cyclins E and D2, transcriptional repression of a viral promoter/enhancer element, dimerisation/oligomerisation, chromatin association, the replication of terminal repeat containing plasmids and the interaction with cellular proteins such as the retinoblastoma tumour suppressor protein. Hence, the MHV-68 orf73 protein could potentially provide a valuable model system to investigate orf73 protein function in vivo in mice. Additionally, based on the earlier observation by our group, that KSHV LANA-1 interacts with BRD2/RING3, we demonstrated KSHV LANA-1 and the orf73 homologs to interact with the celluar bromodomain-containing proteins BRD2/RING3 and BRD4/HUNK. Bromodomains are chromatin-targeting modules and BRD2 and BRD4 are known to interact with chromatin and to modulate transcription and cell cycle events. We showed the C-terminal regions of BRD2 and BRD4 to be responsible for binding to orf73 proteins. Further, we identified a conserved region in the C-terminal regions of orf73 proteins to be crucial for BRD2 and BRD4 binding. Orf73 proteins of MHV-68 and RRV increased the expression levels of BRD2 and BRD4 in cotransfected cells. Further, we showed that activation of the cell cycle- dependent cyclinE promoter by BRD4 was negatively regulated by the orf73 proteins of KSHV and RRV. Using dominant negative BRD4 mutants and an siRNA approach, we provide initial data indicating a role of BRD4 in the KSHV LANA-1 mediated replication of a terminal repeat containing plasmid.

Das Kaposi Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) is hauptsächlich für immunsupprimierte Individuen ein Pathogen von großer Bedeutung. Ein Protein mit wichtigen Funktionen während der viralen Latenz ist im offenen Leserahmen 73 (orf73) von KSHV kodiert, das Latenz-assoziierte nukleäre Antigen 1 (LANA-1). Jedoch wurde ein Großteil der Erkenntnisse über LANA-1 in vitro erforscht. Die Infektion der Maus mit dem natürlichen Mäusepathogen MHV-68 (Murines Gammaherpesvirus 68) könnte potenziell ein geeignetes Tiermodell zum Studium γ2-herpesviraler orf73-Proteine darstellen. Deshalb definieren wir in dieser Arbeit zunächst funktionelle Gemeinsamkeiten und Unterschiede von KSHV LANA-1 und den homologen orf73-Proteinen von den verwandten γ2-Herpesviren RRV (Rhesus Rhadinovirus), HVS (Herpesvirus Saimiri) und MHV-68. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass das MHV-68 orf73-Protein viele der bekannten funktionellen Eigenschaften des KSHV LANA-1 Proteins teilt. So können das MHV-68 orf73-Protein und LANA-1 Zellzyklus-abhängige Promotoren der Zykline E oder D2 transkriptionell aktivieren, virale Promotoren transkriptionell reprimieren oder Dimere bilden. Außerdem sind LANA-1 und das MHV-68 orf73-Protein chromatinassoziiert, vermitteln die Replikation von Plasmiden, die terminale Wiederholungseinheiten des jeweiligen Virusgenoms enthalten, und sie interagieren mit zellulären Proteinen wie dem Retinoblastoma Protein, einem bekannten Tumorsuppressorprotein. Unsere Daten unterstützen deshalb die Möglichkeit, MHV-68 als Modell zum in vivo Studium der Funktion von γ2-herpesviralen orf73-Proteinen einzusetzen. Ein weiterer Teil der Arbeit besteht in der Charakterisierung von Protein-Protein Interaktionen. Wir zeigen, dass KSHV LANA-1 und die homologen orf73-Proteine mit den zellulären Proteinen BRD2/RING3 und BRD4/HUNK interagieren. BRD2 und BRD4 enthalten sogenannte Bromodomänen, die für die Chromatinbindung von BRD2 und BRD4 verantwortlich sind. Wir zeigen in dieser Arbeit detailliert, dass orf73-Proteine mit BRD2 und BRD4 über Ihre jeweiligen carboxyterminalen Proteindomänen interagieren. BRD2 und BRD4 beinflussten in unseren Versuchen den Zellzyklus und die Transkription. Interessanterweise erhöhten die orf73-Proteine von RRV und MHV-68 die Proteinexpression von BRD2 und BRD4. Außerdem zeigen wir, dass die orf73-Proteine von RRV und KSHV eine BRD4-vermittelte Aktivierung des Zyklin E Promotors negativ regulieren, was erste Hinweise auf eine Interaktion von orf73-Proteinen und BRD4 bei der Zellzyklussteuerung liefert. Weiterhin konnten wir durch die Verwendung dominant-negativer BRD4 Proteine und durch Anwendung von BRD4-spezifischer siRNA erste Hinweise auf eine Beteiligung von BRD4 an der LANA-1 vermittelten latenten Replikation finden.

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Ottinger, Matthias: Functional characterisation of [gamma]2-herspeviral orf73 proteins and their interaction with the callular proteins BRD2 and BRD4. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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