Verbesserung der Tiefgefrierfähigkeit geschlechtsspezifisch sortierter Hengstspermien

Buß, Heide Friederike

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Verbesserung der Tiefgefrierfähigkeit geschlechtsspezifisch sortierter Hengstspermien

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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zufriedenstellende Methodik zur Tiefgefrierung flowzytometrisch sortierter Spermien zu erstellen. Anhand sortierter Spermien zweier Hengste wurden drei Versuchsreihen zum Vergleich von zwei Tiefgefriersystemen, zwei Verdünnern und zwei Glyzerinkonzentrationen durchgeführt. Die Qualität der Spermien wurde nach dem Auftauen anhand der Spermaparameter Motilität, Akrosomintegrität und Morphologie bestimmt und zusätzlich die sortierten Spermien mit den auf gleiche Art behandelten unsortierten Kontrollgruppen verglichen. Bei den in Versuchsreihe 1 verglichenen Systemen handelte es sich um eine Styroporbox und einen automatischen Gefrierapparat. In der Styroporbox wurden die Pailletten im Stickstoffdampf für mindestens 7 Minuten kryokonserviert. Für die Kryokonservierung im automatischen Gefrierapparat wurden Pailletten kontrolliert mit einer Kühlrate von –60°C/min. bis auf –160°C eingefroren. Es folgten jeweils der Transport bzw. die Lagerung in flüssigem Stickstoff bei –196°C und die Auswertung nach dem Auftauen für 30 Sekunden im 37°C warmen Wasserbad. Die Proben im System Box kühlten zunächst deutlich schneller, nach Durchschreiten einer Temperatur von ungefähr –20°C deutlich langsamer ab als jene im Automaten. Unterschiede der Spermienqualität zwischen den Tiefgefriersystemen bestanden nicht, so dass aufgrund der technischen Verfügbarkeit in den weiteren Untersuchungen zur Tiefgefrierung von sortierten Hengstspermien für einen Besamungsversuch auf die computergesteuerte Anlage verzichtet wurde. In Versuchsreihe 2 fand ein Vergleich zwischen den beiden Verdünnern INRA82 mit 2% Eidotter und 2,5% bzw. 5% Glyzerin sowie Lactose-EDTA mit 20% Eidotter und 4% Glyzerin statt. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Verdünnern. Im INRA82-Verdünner wurden in der Versuchsreihe 3 die Glyzerinkonzentrationen 2,5% und 5% miteinander verglichen. Die Spermaproben wurden zunächst ohne Zugabe von Glyzerin an 5°C angepasst, danach erfolgten die Glyzerinzugabe, das Abfüllen und die Kryokonservierung. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen. Der Anteil beweglicher sortierter Spermien war gegenüber dem der unsortierten Kontrollgruppen deutlich reduziert. Die Werte unterschieden sich jedoch nach einer Zeit von 30 Minuten (Hengst 2), 60 Minuten (Gesamtbetrachtung) bzw. 90 Minuten (Hengst 1) im Thermoresistenztest nicht mehr signifikant. Hinsichtlich der Akrosomintegrität und der Morphologie gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen gesexten und ungesexten Spermien. Um Besamungsportionen für die Überprüfung der Fertilität tiefgefrorener sortierter Spermien bereit zu stellen, wurden die Styroporbox als Tiefgefriersystem und der Lactose-EDTA-Verdünner mit 4% Glyzerin als Tiefgefriermedium ausgewählt. Im Frühjahr 2004 wurden insgesamt ca. 30 Besamungsportionen mit sortierten Spermien jedes Hengstes und eine entsprechende Anzahl Kontrollgruppen tiefgefroren. Besamungsversuche werden zur Zeit von einer australischen Arbeitsgruppe der Universität Sydney durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein vorläufiges Protokoll zur Kryokonservierung sortierter Spermien erstellt, das den Erhalt der Motilität entsprechend den Mindestanforderungen von 30% nach dem Auftauen für ca. 30 Minuten im Thermoresistenztest gewährleistet. Eine Besamung mit diesen Spermien sollte daher derzeit möglichst kurz nach dem Auftauen und ovulationsnah erfolgen.

The objective of the present investigation was to develop a method for the cryopreservation of flow-sorted sperm. Three series of tests were carried out using the sorted sperm of two stallions to compare two freezing systems, two extenders and two glycerol concentrations. The quality of the frozen/thawed semen was determined by the sperm parameters of motility, acrosome integrity and morphology. Frozen/thawed flow sorted sperm was also compared with frozen/thawed non-sorted spermatozoa. The first trial involved a comparison of freezing systems. One was simply a styrofoam box filled with liquid nitrogen and the other was a programmable freezing device. Straws of semen to be frozen in nitrogen vapour were placed onto a rack over liquid nitrogen in the styrofoambox for 7 minutes and then were submerged into the liquid nitrogen. For cryopreservation with the automatic freezing system, straws were cooled using a programmed rate of 60°C per minute down to a temperature of –160°C. At this point the straws were plunged into liquid nitrogen for storage at –196°C. In both systems, the straws were thawed in a waterbath for 30 seconds at 37°C and evaluated. Samples cooled in nitrogen vapor in the styrofoam box system were found to cool much faster initially but, after reaching a temperature of –20°C, their cooling rate was slower than that of samples in the programmed device. Since there was no difference in the quality of sperm frozen by these two methods, the more simple nitrogen vapor cooling system was used for the rest of the study. Experiment 2 involved a comparison of freezing success using two different extenders. The first consisted of INRA82-extender supplemented with 2% egg-yolk and 2.5% or, in some cases, 5% glycerol. The second consisted of lactose-EDTA-extender supplemented with 20% egg-yolk and 4% glycerol. Again, there was no statistically significant difference between the two experimental groups. Experiment three examined the effect of glycerol concentration. Glycerol concentrations of 2.5% and 5% were both compared using the INRA82-extender. In this test, the samples were first cooled to 5°C without glycerol and then precooled glycerol was added to give the desired concentration and the semen was placed into straws for freezing. There was no significant difference between the two different concentrations of glycerol. In all cases, the post-thaw motility of sexed spermatozoa were significantly reduced in comparison to that of unsorted sperm immediately after thawing, however, after incubation at 38°C for 30 minutes the sperm from stallion 2 no longer showed any difference between the two groups, after 60 minutes pooling the data for both stallions showed no significance difference between groups however, the sperm from stallion 1 alone showed a significant difference until they had been incubated for 90 minutes. The analysis of acrosome integrity and morphology revealed no significant difference between sorted and unsorted sperm. The final experiment involves a field study of the fertilization competence of sexed sperm. For this experiment, sperm were frozen with nitrogen vapour cooling in a styrofoam box using lactose-EDTA-extender with 4% glycerol. In spring 2004, 30 insemination doses of flow-sorted sperm and a corresponding number of doses of non-sorted sperm were prepared from each stallion. Insemination is currently being performed by Australian colleagues at the University in Sydney. In the work described above, a satisfactory method for the cryopreservation of sorted stallion sperm was developed, which gives a motility of 30% for a period of 30 minutes in a post-thawing thermal resistance test. We conclude that insemination with frozen/thawed sexed stallion sperm should be performed immediately after thawing and at a time very close to the point of ovulation.