Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss von parasitären Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim Sommerekzem des Pferdes

Heselhaus, Julia Elisabeth

Type I reaction comprises essential physiological immunomechanisms providing alert reactions and immunomodulatory influence as known e.g. for the control of intestinal parasites. In case of type I allergic diseases this mechanism appears to be beyond physiological control. Both forms of type I reactions, the physiological as well as the pathological one, can occur in one individual and might influence one another. This may be one reason why allergic diseases seem to be less frequent in areas with endemic helminthosis than in industrial countries. Nearly all horses kept on pasture in Germany are infected with helminths. In spite of that, however, some of them suffer form summer eczema, a type I allergy against salivary components of various biting insects, one of which is Culicoides nubeculosus. The aim of this study was to investigate the modulating influence of parasitic antigens on allergen- and parasite-specific sensitisation of equine basophilic granulocytes in a functional in-vitro-test (FIT) monitoring the amount of histamine released upon triggering the basophils in vitro under controlled conditions. Main studies were performed on a herd of 27 Icelandic horses eleven of which had clinical signs of summer eczema. These studies included two different recombinant proteins of sheep nematode Trichostrongylus colubriformis (called “TcA” and “TcB”) as several of these horses showed sensitisation of their basophils for these proteins in the FIT without those horses suffering from “worm allergy”. Two approaches were taken in order to alter the profile of sensitizing antibodies for allergen and parasitic antigen resp. TcA and TcB on the basophils: one by immunisation with both recombinant proteins, and the other one by anthelmintic treatment of horses some of which were partially heavily infected with nematodes. The aim was to shift the sensitisation pattern of newly generated basophils away from allergen towards parasite specific antibodies, particularly after elimination of previous basophils by corticosteroids. Anthelmintic treatment with moxidetin and praziquantel induced a powerful inhibition of allergen-, antigen- and antibody-induced histamine release from basophils monitored seven days after treatment in nearly all horses. The magnitude of reduction depended on the individual parasitic load. The reduced activity of basophils towards Fc-receptor mediated triggering suggested a functional suppression via inhibitory Fcγ-receptors IIb. This might resemble a mechanism of self-protection from overshooting immunoreactions caused by excessive reactions to the high amount of released parasitic antigen. Three weeks after anthelmintic treatment only very few horses still presented a reduced specific sensitivity for single allergens. Latest three months after anthelmintic treatment latest all animals had returned to their previous levels of reactivity in the FIT. In contrast to the general trend of reduced reactivity three horses showed even an increased sensitivity to allergens seven days post anthelmintic treatment. One of them maintained enhanced reactivity at least three months. If the basophils were eliminated from peripheral blood by a corticosteroid seven days after deworming, thus, at the peak time of functional inhibition, the reduced reactivity towards allergens was prolonged for at least another two weeks, while the triggering by TcA and TcB was not suppressed. For a short period of time (at least two weeks after injection of corticoid and three weeks after anthelmintic treatment) a kind of the intended down modulation of allergen specific reactivity of basophils could be considered. No long term effect, however, was achieved. Applying a corticosteroid without a preceding release of parasitic antigen by deworming an increase of sensitisation for allergens was observed two weeks after injection. An attempt to raise or induce antibody titres in the serum against the recombinant proteins TcA and TcB by immunisation resulted in a sudden mast cell degranulation in the caecum and the colon exerting an overshooting type I reaction in seven out of nine horses by means of haemorrhagic diarrhoea and secondary hypovolaemic shock within ten minutes to six hours after injection of the proteins. Emergency treatment included application of a corticosteroid, thus eliminating the basophils. Seven days later the horses showed the same pattern of sensitisation as those who had received the corticosteroid after anthelmintic treatment. The basophil reaction towards allergens was reduced or had disappeared, but was fully maintained for TcA and TcB. Again a kind of the intended modulation was achieved, but had no long term effect. Indirekt ELISA systems were developed for quantification of serum antibodies against the recombinant proteins TcA, TcB and an extract of Cyathostominae spp., representing a high amount of various nematode antigens. Antibodies were differentiated by the equine isotypes IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 and IgG5 were tested. No free serum antibodies against TcB were decetable, although basophils were functionally sensitized for TcB. Antibodies of all isotypes but IgE were found against TcA in all immunized as well as in some control horses. Some of the horses displayed a distinct functional sensitization of their basophils towards TcA without any detectable anti-TcA antibodies in the serum. Thus, the sensitization of basophils was obviously independent from the titre of free antibodies of the monitored isotypes determined in the ELISA. This might be due to an involvement of not monitored isotypes in sensitization of basophils or in a high selectivity of not detectable antibodies for the activating Fc-receptors. Cyathostominae-specific IgG1 titre of four out of six horses contradicted literature documented findings in other species: two animals with a low number of faecal nematode eggs had also low titres, while two others with high numbers of faecal nematode eggs had also high titres of antibodies reacting with Cyathostominae spp.. Monitoring of total serum IgE in eleven horses revealed that five horses with an increase of total IgE in autumn showed a decreased reactivity of their basophils towards allergens, a finding confirming previous reports from other authors of our group. Horses which did not show an increase of total IgE had no reduction of allergen-specific reactivity of their basophils. There was no correlation between the total serum IgE and allergic dermatitis in the investigated horses. The decrease of total IgE after anthelmintic treatment known in humans could be confirmed in this study.

Die Typ-I-Reaktion beschreibt physiologische Alarm- und Immunregulationsmechanismen, die auch bei der Kontrolle von Endoparasiten eine hervorragende Rolle spielen. Im Falle einer Typ-I-allergischen Erkrankung scheinen diese Schutzmechanismus der physiologischen Kontrolle entglitten zu sein. Dabei können beide Formen, die physiologisch-schützende und die pathologische, parallel innerhalb desselben Individuums auftreten und sich möglicherweise gegenseitig beeinflussen. So ist bekannt, dass allergische Erkrankungen beim Menschen in Ländern mit endemischen Helminthosen bedeutend seltener vorkommen als in den Industrieländern. In Weidehaltung gehaltene Pferde in Deutschland sind nahezu immer mit Helminthen infiziert, und bei einem Teil dieser Tiere tritt u. a. das sog. Sommerekzem auf, eine Typ-I-Allergie auf Speichelbestandteile verschiedener blutsaugender Insekten, insbesondere Culicoides nubeculosus. In dieser Arbeit sollte mittels eines Funktionellen Invitro- Testes (FIT) anhand der Histaminfreisetzung untersucht werden, ob parasitäre Antigene einen modulierenden Einfluss auf die allergen- und parasitenspezifische Sensibilisierung equiner basophiler Granulocyten haben. Dafür standen neben einer Herde von 27 Islandpferden, davon elf mit klinischen Symptomen des Sommerekzems, zwei verschiedene rekombinante Proteine aus einem Schafnematoden, Trichostrongylus colubriformis, („TcA“ und „TcB“) zur Verfügung. Vorversuche hatten gezeigt, dass einige Pferde im FIT auf diese Proteine mit einer Histaminfreisetzung reagieren, ohne Symptome einer „Wurmallergie“ zu zeigen. In zwei verschiedenen Modulationsversuchen wurde eine Veränderung der allergen- und parasiten- bzw- TcA-/TcB- spezifischen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten angestrebt: durch eine Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB und durch eine anthelminthische Behandlung der teilweise stark mit Nematoden belasteten Pferde. Das danach veränderte Antikörperspektrum sollte die Sensibilisierungen von neu gebildeten Basophilen möglicherweise zugunsten der parasitenspezifischen Sensibilisierungen verschieben, nachdem zuvor die vorhandenen Basophilen mittels Corticosteroiden eliminierten worden waren. Schon die reine anthelminthische Behandlung (mit Moxidectin und Praziquantel) bewirkte zum Untersuchungszeitpunkt sieben Tage nach der Entwurmung eine starke, vom individuellen Verwurmungsgrad abhängige Hemmung der allergen-, antigen- und antikörpervermittelten Histaminfreisetzung bei nahezu allen Pferden. Diese Reduktion der Stimulationsfähigkeit der Basophilen gab anhand der erhobenen Daten Hinweise auf eine möglicherweise Fcγ-Rezeptor IIb-vermittelte Hemmung der Zellen als Selbstschutzmechanismus vor einer überschießenden Reaktion auf die hohe Antigenanflutung. Drei Wochen nach der Entwurmung konnte eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierung nur noch in einigen wenigen Fällen festgestellt werden, spätestens nach drei Monaten waren alle Tiere wieder auf ihre Ausgangswerte zurückgekehrt. Drei der Pferde zeigten im Gegensatz zu den anderen sieben Tage nach der anthelminthischen Behandlung eine verstärkte Sensibilisierung gegen Allergene, die in einem Fall auch über mindestens drei Monate erhalten blieb. Wurden die basophilen Granulocyten sieben Tage nach der Entwurmung (also zum Zeitpunkt der festgestellten Hemmung der Histaminfreisetzungen) mittels einer Corticosteroid-Behandlung „ausgetauscht“, konnte der allergenspezifische Reduktionseffekt für mindestens zwei weitere Wochen erhalten werden. Nur eine Sensibilisierung gegen die Parasitenproteine TcA und TcB war nicht supprimiert. Nach drei Monaten befanden sich die Sensibilisierungen sowohl gegen die untersuchten Allergene als auch gegen die rekombinanten Parasitenproteine wieder auf dem Ausgangsniveau vor der anthelminthischen Behandlung. Für einen kurzen Zeitraum (mindestens zwei Wochen nach der Corticoidinjektion und drei Wochen nach der Entwurmung) konnte möglicherweise von einem Modulationserfolg im Sinne der Fragestellung gesprochen werden. Ein Langzeiterfolg konnte aber nicht erzielt werden. Bei einer Anwendung des Corticoides ohne vorhergehende Parasitenantigenfreisetzung durch die anthelminthische Behandlung konnte vierzehn Tage nach der Injektion eine deutliche Steigerung der allergenspezifischen Sensibilisierung beobachtet werden. Der Versuch, den TcA- und TcB-spezifischen Antikörpertiter durch eine Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen anzuheben und danach die Basophilen zu aktualisieren, resultierte innerhalb kürzester Zeit (zehn Minuten bis sechs Stunden) in einer an Colon und Caecum lokalisierten Mastzelldegranulation im Sinne einer überschießenden Typ-I-Reaktion, zu hämorrhagischem Durchfall und zu einem sekundären hypovolämischen Kreislaufschock. Die Pferde wurden im Rahmen der Erstversorgung auch mit einem Corticoid behandelt und so auch hier die Basophilen eliminiert. Sieben Tage später wiesen sie ein ähnliches Sensibilisierungsmuster auf wie die Pferde, die nach der anthelminthischen Behandlung das Corticoid erhalten hatten: die allergenspezifische Reagibilität war deutlich vermindert oder hatte sich ganz verloren, die gegen TcA und TcB war vorhanden. Auch hier konnte möglicherweise ein Erfolg der Modulation angenommen, aber kein Langzeiteffekt beobachtet werden. Im entwickelten Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und, als Vertreter der Gesamtheit der Parasitenantigene, einen Extrakt aus Cyathostominae spp. wurden die Isotypen IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 untersucht. Gegen TcB konnten bei deutlich vorhandener funktioneller Sensibilisierung der Basophilen für keinen untersuchten Isotyp freie Antikörper nachgewiesen werden. Gegen TcA waren Antikörper aller untersuchten Isotypen außer IgE nachweisbar, sowohl bei den immunisierten als auch bei einem Teil der nicht immunisierten Pferde. Bei einzelnen Pferden war auch ohne den ELISA-Nachweis freier Anti-TcAAntikörper eine deutliche TcA-Sensibilisierung der Basophilen zu beobachten. Die funktionelle antigenspezifische Sensibilisierung der Basophilen war somit unabhängig vom Nachweis freier Antikörper der untersuchten Isotypen im Serum. Dies legt entweder eine Beteiligung von Antikörpern der hier nicht untersuchten Isotypen an der Sensibilisierung der Basophilen nahe oder eine sehr selektive Affinität von Antikörpern, die unterhalb der Nachweisgrenze des ELISA-Systems liegen, für die aktivierenden Fc-Rezeptoren. Der strongylidenspezifische IgG1-Spiegel verhielt sich bei vier von sechs untersuchten Pferden anders als in der Literatur beschrieben. Zwei Pferde mit geringer Eiausscheidung zeigten niedrige, zwei mit hoher Ausscheidung hohe IgG1-Titer gegen Cyathostominae spp. Eine Untersuchung des Gesamt-IgE-Spiegels bei elf Pferden ergab für fünf Pferde, dass sie parallel zum Anstieg des Gesamt-IgE im Herbst eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierung ihrer Basophilen aufwiesen, ein Zusammenhang, den schon andere Autoren unserer Arbeitsgruppe gezeigt hatten. Andere Tiere, bei denen kein Anstieg festgehalten werden konnte, zeigten keinen Rückgang der allergenspezifischen Sensibilisierung. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe des Gesamt-IgE-Titers und einer allergischen Erkrankung wie beim Menschen konnte beim Pferd nicht festgestellt werden. Das auch aus der Humanmedizin bekannte Absinken des Gesamt-IgE-Spiegels nach einer anthelminthischen Behandlung zeigte sich aber auch in dieser Studie.

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Heselhaus, Julia Elisabeth: Untersuchungen zum Einfluss von parasitären Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim Sommerekzem des Pferdes. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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