Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen

Holst, Christine Rita

The gastrointestinal (GI) nematodes belong to the most important endoparasites in small ruminants. They cause high economic losses. A prophylactic treatment is necessary. The biological control of parasites, for example the use of nematophagous fungi, becomes more important, because of increasing problems with anthelminthic resistance. The aim of this study was to investigate the influence of the nematophagous fungus Duddingtonia flagrans on the infection risk for small ruminants in a field study in northern Germany. Additionally, a simplified method for the identification of infective larval stages of GI-nematodes by real-time PCR should be developed.  Twenty milk goats of the breed “Bunte Deutsche Edelziege” and 20 sheep (19 of the breed “Ostfriesisches Milchschaf” and one of the breed “Merino”) were daily fed for three month with 5x105 spores of Duddingtonia flagrans. The experiments were carried out in summer 2002 and took place in the institute for ecological farming in Trenthorst, 23847 Westerau, Germany. In addition, control-groups of the same size and without any contact to spores of D. flagrans were arranged. Every fortnight the differences between all groups were analysed, regarding body condition, eggs per gram faeces and larval development in faeces and on pasture. Following, 20 randomly choosen larval cultures, 6 pasture samples of the trial in summer 2002 and 9 specially prepared pasture samples were examined by real-time PCR. The non-fed control goats showed 1235 (±518) eggs / g faeces after being fed with the spores for 3 month, compared to 517 (±654) eggs / g faeces in the fungus group. This difference proves to be statistical significant (p<0,001). Regarding the sheep groups, no statistical significant difference (p≥0,5) could be found. At the end of July, the fungus group had 397 (±628) eggs per g faeces in comparison to 584 (±1329) eggs per g faeces in the control group. The maximum in larval reduction was found at the end of the fungus-feeding period. The larval reduction in the sheep- and in the goat-groups amounted 81,2 % and 67,9 % respectively. There was no statistical significant difference obvious (p≥0,05). During the summer the body condition increase in the fungus-treated groups were higher by 1,73 kg in goats and 0,52 kg in sheep, compared to the control groups. There were no statistical significant differences (p≥0,05). Cooperia-, Haemonchus-, Teladorsgia-, Trichostrongylus-, and Oesophagostomum-larvae could be detected in every larval culture in the trial. There were no statistical significant differences between the groups (p≥0,05). The efficiancy of the fungus is mainly seen in the goat groups. Though, the heterologous results show up the susceptibility to trouble, for examples by climatic or feeding interferences. From mid of September there were increasing differences in larval counts on pasture. There were 243 L3 / 100 g dry matter found on pasture of non fungus-fed goats and 77 L3 / 100 g dry matter on pasture of the fungus group. At the same time the pasture-larval counts of the fungus sheep group were 370 L3 / 100 g dry matter and  135 L3 / 100 g dry matter in the control group. There were no statistical significant differences (p≥0,05). Corresponding to the microscopical results, the real-time PCR detected larvae of Cooperia, Haemonchus, Teladorsagia and Trichostrongylus. Comparing the percental composition of all kinds of larvae for microscopical and molecular analysis, 2 samples out of 20 showed differences of less than 10 % for all kinds. The maximum difference was 90,1 %. After a second wash of the DNA,  a Ct-cycle smaller than 39,0 for every primer and probe combination could be detected. The counts of copies of DNA for 5000 L3 in the samples were at least 2,79x102 (±5,25x100) copies / µl for Teladorsagia and at most 4,25x106 (±5,39x105) copies / µl for Haemonchus. In 50 % of the examined samples from the field trial in 2002 and in 88,9 % of specially prepared pasture samples, helminthic DNA was evident. Because of its higher sensitivity and practicability, the DNA-detection in  pasture samples can be used as a good alternativ. However, further investigations for the quantitativ detection of helmintic DNA by real-time-PCR are necessary.

Die Magen-Darm-Strongyliden zählen weltweit zu den wichtigsten Endoparasiten bei kleinen Wiederkäuern. Sie verursachen hohe wirtschaftliche Verluste. Eine Prophylaxe/Metaphylaxe ist notwendig. Da in den letzten Jahren die Anthelminthikaresistenzen bei den Helminthen stark gestiegen sind, gewinnt die biologische Kontrolle der Parasiten, z. B. durch den Einsatz nematophager Pilze, immer mehr an Bedeutung. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des nematophagen Pilzes Duddingtonia flagrans auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei kleinen Wiederkäuern unter praxisnahen Bedingungen auf einem norddeutschen Betrieb zu untersuchen. Im zweiten Teil der Arbeit sollte eine möglichst zeitsparende Methode zur Gattungsbestimmung von infektiösen Larven von Magen-Darm-Strongyliden mittels Real-time PCR entwickelt werden. Im Institut für ökologischen Landbau in Trenthorst, 23847 Westerau, wurden 20 Milchziegen der Rasse „Bunte Deutsche Edelziege“ und 20 Milchschafe (19 Ostfriesische Milchschafe und ein Merinolandschaf) im Sommer 2002 drei Monate lang täglich mit 5x105 Sporen von Duddingtonia flagrans gefüttert. Die Unterschiede in der Körpergewichtsentwicklung, Eiausscheidung pro g Kot und Larvenentwicklung pro g Kot und auf den Weiden wurden im Vergleich zu gleich großen, nicht behandelten Kontrollgruppen 14-tägig untersucht. Im Anschluss wurden exemplarisch 20 Larvenkulturen sowie 6 Grasauswaschproben aus der Felduntersuchung und 9 präparierte Grasauswaschproben in der Real-time PCR untersucht. Nach dreimonatiger Pilzfütterung zeigten die Ziegen der Kontrollgruppe mit 1235 (±518) Eiern/g Kot im Vergleich zur Versuchsgruppe mit 517 (±654) Eiern/g Kot in der Versuchsgruppe eine signifikant höhere Eiausscheidung (p<0,001). Die Schafe der Versuchsgruppe zeigten Mitte Juli eine mittlere Eiausscheidung von 397 (±628) Eiern/g Kot, die mittleren Eizahlen der Kontrollgruppe lagen bei 584 (±1329) Eiern/g Kot. Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant (p≥0,05). Über die gesamte Dauer des Versuchs konnten in den Larvenkulturen die Magen-Darm-Strongyliden-Gattungen Cooperia, Haemonchus, Teladorasia, Trichostrongylus und Oesophagostomum nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Unterschiede durch die Einflussnahme der Pilzfütterung konnten nicht beobachtet werden. Ebenfalls nach dreimonatiger Fütterung des Pilzes konnte die maximale Reduktion der Larvenentwicklung pro g Kot durch D. flagrans ermittelt werden. Diese betrug für die Schafgruppe 81,2% und für die Ziegengruppe 67,9%. Im Verlauf der Saison nahmen die behandelten Ziegen 1,73 kg, die behandelten Schafe 0,52 kg mehr Körpergewicht zu als die unbehandelten Vergleichstiere. Dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant (p=>0,05). Ab Mitte September stellten sich Differenzen in der Larvenanzahl auf den Weiden ein. Die Weide der unbehandelten Gruppe der Ziegen zeigte 243 L3/100g TM im Vergleich zu 77 L3/100g TM der Versuchsgruppenweide. Zum selben Zeitpunkt lagen die Larvenzahlen auf der Weide der Versuchgruppe der Schafe bei 370 L3/100g TM und in der Kontrollgruppe bei 135 L3/100g TM. Diese Ergebnisse zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede (p≥0,05). Eine tendenzielle Wirkung des Pilzes ist vor allem in den Ziegengruppen zu erkennen. Allerdings zeigen die heterologen Ergebnisse auch die Störanfälligkeit des Pilzes, wie z. B. durch Klimabedingungen oder Futterakzeptanz. Mit der Real-time PCR konnten übereinstimmend mit den mikroskopischen Ergebnissen die Gattungen Cooperia, Haemonchus, Teladorsagia und Trichostrongylus nachgewiesen werden. Bei einem Vergleich der prozentualen Anteile der einzelnen Gattungen bei mikroskopischer und molekularbiologischer Untersuchung lagen für 2 von 20 Proben die Differenzen der Anteile für alle vier Gattungen unter 10 %. Bei den übrigen 18 Proben lagen die maximalen Differenzen bei bis zu 90,1 %. Durch zweimaliges Reinigen der DNA der Grasauswaschproben über eine Chromatographiesäule konnten für jede Primer- und Sondenkombination Ct-Werte <39,0 ermittelt werden. Die errechneten DNA-Kopienzahlen für 5000 L3 in der Ausgangsprobe lagen zwischen 2,79x102 (±5,25x100) Kopien pro µl für die Gattung Teladorsagia und 4,25x106 (±5,39x105) Kopien pro µl für die Gattung Haemonchus. Für 50% der untersuchten Feldproben aus 2002 und 88,9 % der eigens präparierten Proben konnte DNA nachgewiesen werden. Der DNA-Nachweis in Grasproben stellt durch seine höhere Sensitivität eine gute und prakitikable Alternative zur Mikroskopie dar. Allerdings sind weitergehende Untersuchungen zum quantitativen Nachweis von Helminthen-DNA mittels Real-time-PCR nötig.

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Holst, Christine Rita: Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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