Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung einer Polymerasekettenreaktion zum Nachweis von Brachyspira hyodysenteriae aus Schweinekot

Hue, Melanie

B. hyodysenteriae is the etiological agent of swine dysentery, one of the most frequent and most fatal diseases in pig herds. The excretion of B. hyodysenteria not only occurs during the clinical disease, but already during the incubation period, and might also last up to ten weeks after the clinical recovery of the animal. The asymptomatic carriers and excretors of B. hyodysenteriae, in particular breeding pigs, represent the most important source for the spreading of swine dysentery. This shows that there is a necessity to identify quickly and safely the presence of a latent infection. The cultural-biochemical identification method usually applied in fact enables an exact agent diagnosis, but it takes at least six days. Further, the sensitivity of this method is too low in clinically healthy carrier pigs. The aim of this thesis was the development of a direct PCR assay for the detection of B. hyodysenteriae in faeces which is suitable in daily practice, and which enables the diagnosis within a few hours even from dead bacteria. This would enable a short-term detection of the B.-hyodysenteriae carriers, and a supplementary purchase of such animals to B.-hyodysenteriae free herds could by avoided. At first, 87 Brachyspira strains of various species were cultured for the development of the PCR. This was followed by the preparation of the DNA with the QIAamp® DNA Mini Kit of the company Qiagen. Since the species and quantity of the Brachyspira-DNA were known, it could be used for the experiments to develop the direct PCR. The primer pairs BitA, BitD and pBh were selected from ten tested primer pairs, and an optimum annealing temperature of 58°C in a touchdown-PCR as well as a concentration of 6 mM of MgCl2 was found to be most suitable. With the PCR assay developed, the cultural-biochemical diagnosis already performed previously, could be confirmed in all 87 cultured strains. The PCR was reduced in a user-friendly way so that a species differentiation of B. hyodysenteriae takes place towards the low-pathogenic species, and towards the non-pathogenic ones. The PCR diagnosis to be made is: „Brachyspira hyodysenteriae present in sample“ or „Brachyspira hyodysenteriae absent in sample“. The genus specificity of the developed Brachyspira-PCR was evidenced by testing 39 non-Brachyspira strains (representing 22 genera which are usually found in the intestine of pigs). None of them produced a signal under the PCR conditions described. The cloning of a control plasmid (pBIS3) took place simultaneously as an internal inhibition control of the PCR which was supposed to indicate the occurence of false negative results. Moreover, the PCR assay developed was put to test with 87 randomly chosen stool samples of pigs. Same had already been diagnosed by aid of the cultural-biochemical identification method. Prior to the actual PCR, the extraction of the DNA took place from the stool samples with the QIAamp® DNA Stool Mini Kit of the company Qiagen. The comparison of the results of the cultural-biochemical identification method with the direct PCR showed a correspondence of the diagnoses of all 78 tested non-B. hyodysenteriae species. The cultural-biochemical identification method diagnosed nine of the 87 tested stool samples as B hyodysenteriae positive. Five of them were also tested positive in the direct PCR assay. The reason for the deviating negative result of the four remaining stool samples could not clearly be detected. The good results of the corresponding test series are in contrast to the possibility of an insufficient sensitivity of the direct PCR which showed a maximum sensitivity of 100, and a constant reproducible sensitivity of 102. As a result it can be said that the protocol for performing the direct PCR from pigs‘ stool samples has been totally developed, however at this point a final statement as to the suitability of the PCR assay in daily practice is not yet possible. A future study with a far larger amount of stool samples, especially with B. hyodysenteriae positive stool samples, would clarify this question.

Brachyspira hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie, eine der häufigsten und verlustreichsten Erkrankungen im Schweinebestand. Der Erreger wird nicht nur während der klinischen Erkrankung, sondern bereits während der Inkubationsphase und noch bis zu zehn Wochen nach klinischer Gesundung des Tieres ausgeschieden. Die asymptomatischen Träger und Ausscheider, besonders Sauen, stellen die wichtigste Quelle für die Weiterverbreitung der Schweinedysenterie dar. In dem Bemühen infizierte Bestände zu sanieren, besteht die Notwendigkeit, das Vorliegen einer latenten Infektion sicher und schnell nachzuweisen. Das in der Regel durchgeführte kulturell-biochemische Nachweisverfahren ermöglicht zwar eine genaue Erregerdiagnose, dauert aber wenigstens sechs Tage. Zudem ist die Sensitivität des Erregernachweises dieser Methode bei klinisch gesunden Träger- und Ausscheiderschweinen zu gering. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine praxistaugliche PCR für den Nachweis von B. hyodysenteriae direkt aus Kotproben zu entwickeln. Eine Diagnosestellung ist mit der Direkt-PCR, auch aus abgestorbenen Bakterien, innerhalb von Stunden möglich. Damit wären die Träger von B. hyodysenteriae kurzfristig ermittelbar, und ein Zukauf solcher Tiere in B.‑hyodysenteriae-freie Bestände könnte vermieden werden. Für die Entwicklung der PCR wurden zunächst 87 Brachyspira-Stämme verschiedener Spezies kulturell angezüchtet. Es folgte die Präparation der DNA mit dem QIAamp® DNA Mini Kit der Firma Qiagen. Anhand dieser, in Bezug auf Art und Menge bekannten Brachyspira-DNA konnten die Versuche zur Entwicklung der Direkt-PCR durchgeführt werden. Es wurden von insgesamt zehn getesteten Primerpaaren, die Primerpaare BitA, BitD und pBh ausgewählt, und als optimale Hybridisierungstemperatur 58 °C in einer Touchdown-PCR sowie eine MgCl2-Konzentration von 6 mM im Reaktionsansatz ermittelt. Mit dem entwickelten PCR-Verfahren konnte bei allen 87 kulturell angezüchteten Stämmen die zuvor bereits durchgeführte kulturell-biochemische Diagnose bestätigt werden. Die PCR wurde anwenderfreundlich derartig reduziert, dass eine Artunterscheidung von B. hyodysenteriae zu den schwach- bzw. apathogenen Arten erfolgen kann. Die zu stellende PCR‑Diagnose lautet: „Brachyspira hyodysenteriae in der Probe vorhanden“ bzw. „Brachyspira hyodysenteriae nicht in der Probe vorhanden“. Die entwickelte PCR hat eine hohe Spezifität für Brachyspiren. Mit keiner anderen der 39 untersuchten Nicht-Brachyspira-Arten (zusammengesetzt aus 22 üblicherweise im Schweinedarm vorkommende Gattungen) wurde ein Signal erzeugt. Parallel dazu erfolgte die Klonierung eines Kontrollplasmids (pBIS3) für eine interne Inhibitionskontrolle, welche das Auftreten falsch negativer Ergebnisse anzeigen soll. Weiterhin wurde das entwickelte PCR-Verfahren an 87 zufällig ausgesuchten Schweinekotproben getestet, welche bereits kulturell-biochemisch diagnostiziert waren. Vor der eigentlichen PCR erfolgte die Herauslösung der DNA aus dem Schweinekot mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit der Firma Qiagen. Der Vergleich der Ergebnisse der kulturell-biochemischen Untersuchungen und der Direkt-PCR ergab eine Übereinstimmung der Diagnosen aller 78 Nicht-B.-hyodysenteriae-Arten. Neun der 87 getesteten Kotproben waren kulturell-biochemisch B.-hyodysenteriae-positiv diagnostiziert worden. Fünf dieser Kotproben waren in der Direkt-PCR ebenfalls positiv. Der Grund für das abweichende negative Ergebnis der restlichen vier Kotproben konnte nicht eindeutig nachvollzogen werden. Gegen die Möglichkeit einer mangelhaften Sensitivität der Direkt-PCR sprechen die guten Ergebnisse der entsprechenden Testreihen, welche eine maximale Sensitivität von 100,und eine konstant reproduzierbare Sensitivität von 102 ergaben. Die Arbeitsanleitung zur Durchführung der Direkt-PCR aus Schweinekot wurde vollständig entwickelt. Eine endgültige Aussage über die Routinetauglichkeit des PCR-Verfahrens ist im jetzigen Stadium noch nicht möglich. Eine prospektive Studie mit einem weitaus größeren Probenumfang, besonders mit B.-hyodysenteriae-positiven Proben, würde diese Frage klären.

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Hue, Melanie: Etablierung einer Polymerasekettenreaktion zum Nachweis von Brachyspira hyodysenteriae aus Schweinekot. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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