Etablierung einer Polymerasekettenreaktion zum Nachweis von Brachyspira hyodysenteriae aus Schweinekot

Brachyspira hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie, eine der häufigsten und verlustreichsten Erkrankungen im Schweinebestand. Der Erreger wird nicht nur während der klinischen Erkrankung, sondern bereits während der Inkubationsphase und noch bis zu zehn Wochen nach klinischer Gesundung des Tieres ausgeschieden. Die asymptomatischen Träger und Ausscheider, besonders Sauen, stellen die wichtigste Quelle für die Weiterverbreitung der Schweinedysenterie dar. In dem Bemühen infizierte Bestände zu sanieren, besteht die Notwendigkeit, das Vorliegen einer latenten Infektion sicher und schnell nachzuweisen. Das in der Regel durchgeführte kulturell-biochemische Nachweisverfahren ermöglicht zwar eine genaue Erregerdiagnose, dauert aber wenigstens sechs Tage. Zudem ist die Sensitivität des Erregernachweises dieser Methode bei klinisch gesunden Träger- und Ausscheiderschweinen zu gering. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine praxistaugliche PCR für den Nachweis von B. hyodysenteriae direkt aus Kotproben zu entwickeln. Eine Diagnosestellung ist mit der Direkt-PCR, auch aus abgestorbenen Bakterien, innerhalb von Stunden möglich. Damit wären die Träger von B. hyodysenteriae kurzfristig ermittelbar, und ein Zukauf solcher Tiere in B.‑hyodysenteriae-freie Bestände könnte vermieden werden. Für die Entwicklung der PCR wurden zunächst 87 Brachyspira-Stämme verschiedener Spezies kulturell angezüchtet. Es folgte die Präparation der DNA mit dem QIAamp® DNA Mini Kit der Firma Qiagen. Anhand dieser, in Bezug auf Art und Menge bekannten Brachyspira-DNA konnten die Versuche zur Entwicklung der Direkt-PCR durchgeführt werden. Es wurden von insgesamt zehn getesteten Primerpaaren, die Primerpaare BitA, BitD und pBh ausgewählt, und als optimale Hybridisierungstemperatur 58 °C in einer Touchdown-PCR sowie eine MgCl2-Konzentration von 6 mM im Reaktionsansatz ermittelt. Mit dem entwickelten PCR-Verfahren konnte bei allen 87 kulturell angezüchteten Stämmen die zuvor bereits durchgeführte kulturell-biochemische Diagnose bestätigt werden. Die PCR wurde anwenderfreundlich derartig reduziert, dass eine Artunterscheidung von B. hyodysenteriae zu den schwach- bzw. apathogenen Arten erfolgen kann. Die zu stellende PCR‑Diagnose lautet: „Brachyspira hyodysenteriae in der Probe vorhanden“ bzw. „Brachyspira hyodysenteriae nicht in der Probe vorhanden“. Die entwickelte PCR hat eine hohe Spezifität für Brachyspiren. Mit keiner anderen der 39 untersuchten Nicht-Brachyspira-Arten (zusammengesetzt aus 22 üblicherweise im Schweinedarm vorkommende Gattungen) wurde ein Signal erzeugt. Parallel dazu erfolgte die Klonierung eines Kontrollplasmids (pBIS3) für eine interne Inhibitionskontrolle, welche das Auftreten falsch negativer Ergebnisse anzeigen soll. Weiterhin wurde das entwickelte PCR-Verfahren an 87 zufällig ausgesuchten Schweinekotproben getestet, welche bereits kulturell-biochemisch diagnostiziert waren. Vor der eigentlichen PCR erfolgte die Herauslösung der DNA aus dem Schweinekot mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit der Firma Qiagen. Der Vergleich der Ergebnisse der kulturell-biochemischen Untersuchungen und der Direkt-PCR ergab eine Übereinstimmung der Diagnosen aller 78 Nicht-B.-hyodysenteriae-Arten. Neun der 87 getesteten Kotproben waren kulturell-biochemisch B.-hyodysenteriae-positiv diagnostiziert worden. Fünf dieser Kotproben waren in der Direkt-PCR ebenfalls positiv. Der Grund für das abweichende negative Ergebnis der restlichen vier Kotproben konnte nicht eindeutig nachvollzogen werden. Gegen die Möglichkeit einer mangelhaften Sensitivität der Direkt-PCR sprechen die guten Ergebnisse der entsprechenden Testreihen, welche eine maximale Sensitivität von 100,und eine konstant reproduzierbare Sensitivität von 102 ergaben. Die Arbeitsanleitung zur Durchführung der Direkt-PCR aus Schweinekot wurde vollständig entwickelt. Eine endgültige Aussage über die Routinetauglichkeit des PCR-Verfahrens ist im jetzigen Stadium noch nicht möglich. Eine prospektive Studie mit einem weitaus größeren Probenumfang, besonders mit B.-hyodysenteriae-positiven Proben, würde diese Frage klären.