Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Metamizol hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Levens, Helga

The aim of the present study was to develop and validate the proof of a suitable analytical method of 4-MAA, the main metabolite of dipyrone, in plasma- and urine samples from horses by HPLC/S/MS-method. The basics for the development of a new practical analytical method was an established GC/MS-routine-procedure at the Institute of Biochemistry at the Deutsche Sporthochschule Köln. The establishment of the new analytical method by HPLC/MS/MS went along with the development of an alcaline liquid-liquid-extraction for 4-MAA from plasma- and urine samples of horses. Tertiär-Butylmethylether (TBME) was used as extract solvent. After evaporation of the etherphase the residues were dissolved again in an ammoniumacetat-buffer before they were injected to the HPLC system. The mobile phase consists of Ammoniumacetate that is conform with the initial phase in this method. Dihydrodimethyl-dimethylaminophenylpyrazolone (DMAP) was chosen as internal standard. When the urine samples were analysed with or without hydrolysis it could be observed that 4-MAA in urine of horses is excreted unbound. The limit of quantification for 4-MAA is 1 µg/ml in plasma and 10 µg/ml in urine. The limit of detection is fixed at 0,25 µg/ml in plasma and 0,5 µg/ml in urine. Further we investigated the kinetic of the elimination rate of dipyrone by using its main metabolite 4-MAA in plasma and serum samples. Dipyrone is a nonsteroidal antiinflammatory drug used as therapeutic agent in horses. This study contained a sample size of 10 horses and dipyrone was administrated intravenously in a dose of 30 mg/ kg. Before phamakokinetically investigated, the concentration of 4-MAA were determined via HPLC/MS/MS and fractioned in certain time intervals. The clearance of 4-MAA from the plasma is 338 ± 91 ml/min. The half-life of elimination is 1,7 ± 0,8 hours. During steady-state the volume of distribution is 632 ± 210 ml/kg bodyweight. Non relevant plasma- and urine samples (IPC and IUC) were defined by using the phamakokinetic/ phamakodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002). Latter model is used in research to exclude 4-MAA in organism. Furthermore we analysed the EPC (effective plasmaconcentration). In this present study the EPC is below the value earlier than 10-15 minutes p.a. During a dosage interval of 8 hours IPC and IUC were below the quantification limit in this used model. As a consequence of latter results it isn`t possible to determinate a marginal limit for IPC and IUC and  deductive any positive findings of 4-MAA in urine or plasma samples are definitely doping relevant. KEITZMANN (1983) calculated the elimination rate in plasma focussing the limits of IPC, quantification and detection. In the present study it could be observed that the detected excretion times are similar with those that are in relation to the concentration-time-curve. 12 hours after administration all detected values of all horses were under the limit of quantification. The values of  9 horses reached the limit of detection after 12 hours. The value of one horse was at the limit of detection after 36 hours. In urine the limit of quantification was reached earliest 10-24 and latest 36-48 hours after administration. The limitof detection was reached earliest 33,3 and latest 69-94 hours after administration. Because of the limited number of hourse and wide standard deviation no conclusions can be drawn for the overall clearance-time of 4-MAA.

Das Ziel dieser Arbeit bestand einerseits darin eine geeignete Analysenmethode zum Nachweis von 4-MAA, dem Hauptmetaboliten des Metamizol, im Pferdeplasma und -urin mittels HPLC/MS/MS-Verfahren zu erarbeiten und zu validieren. Grundlage für die Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode war ein im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln bestehendes GC/MS-Verfahren. Mit der Erarbeitung der Messmethode ging die Entwicklung eines basischen Flüssig-Flüssig Extraktionsverfahrens von 4-MAA aus Plasma und Urin von Pferden einher. Als Extraktionsmittel wurde tertiär-Butylmethylether  (TBME) genutzt. Nach Einengung der Etherphase wurden die Proben in Ammoniumacetat-Puffer, dem anfänglichen HPLC-Fließmittel, wieder angelöst und der Messung zugeführt. Als interner Standard wurde Dihydrodimethyl-dimethylaminophenylpyrazolon (DMAP) verwendet. Nach vergleichender Aufarbeitung von Urinproben mit und ohne Hydrolyseschritt konnte gezeigt werden, dass 4-MAA im Urin von Pferden in freier Form ausgeschieden wird. Die Quantifizierungsgrenze für 4-MAA beträgt bei der entwickelten Methode 1 µg/ml Plasma und 10 µg/ml Urin. Die Nachweisgrenze ist im Plasma mit 0,25 µg/ml und im Urin mit 0,5 µg/ml ermittelt. Ein weiteres Ziel dieser Studie bestand darin, Ausscheidungszeiten und die Eliminationskinetik für das häufig bei Pferden eingesetzte nichtsteroidale Antiphlogistikum Metamizol, bzw. dessen Hauptmetaboliten 4-MAA aus Plasma und Urin zu bestimmen. Einer Gruppe von 10 Pferden wurde Metamizol in einer Dosierung von 30 mg/kg KGW intravenös verabreicht. Die 4-MAA-Konzentrationen der zu bestimmten Zeiten p.a. gewonnenen Plasma- und Urinproben wurden mittels HPLC/MS/MS ermittelt und anschließend pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen. Die mittlere Clearance beträgt im Plasma 338 ± 91 ml/min. Die HWZ der Eliminationsphase beträgt durchschnittlich 1,7 ± 0,8 Stunden. Das Verteilungsvolumen unter Steady-State Bedingungen ist durchschnittlich mit 632 ± 210 ml/kg KGW angegeben. Mit Hilfe des multifaktoriellen Einflüssen unterlegenen und damit nicht unumstrittenen pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Modells von TOUTAIN und LASSOURD (2002) wurden sogenannte irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen  (IPC und IUC) ermittelt, bei denen eine Wirkung von 4-MAA auf den Organismus ausgeschlossen sein soll. Zudem wurde eine sogenannte effektive Plasmakonzentration (EPC) ermittelt, die bei den Pferden dieser Ausscheidungsstudie bereits 10 bis 15 Minuten p.a. unterschritten wurde. Die IPC und IUC lagen unter Annahme eines Dosierungsintervalls von 8 Stunden im Durchschnitt jeweils unterhalb der Quantifizierungsgrenze dieser Methode, so dass anhand der vorliegenden Ergebnisse die Festlegung eines Grenzwertes nicht sinnvoll erscheint. Somit ist derzeit jeglicher Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden dopingrelevant. Die Ausscheidungszeit wurde bis zum Erreichen der IPC als auch bis zum Erreichen der Quantifizierungs- und Nachweisgrenze im Plasma berechnet. Die ermittelten Ausscheidungszeiten sind mit den Ausscheidungszeiten, die bei Betrachtung der Konzentrations-Zeit-Kurve erhoben werden können vergleichbar. Die Quantifizierungsgrenze wurde im Plasma bei allen Pferden 12 Stunden p.a. unterschritten. Die Nachweisgrenze wurde von neun Pferden ebenfalls 12 Stunden p.a. erreicht; bei einem Pferd wurde sich jedoch erst nach 36 Stunden unterschritten. Im Urin wurde die Quantifizierungsgrenze frühestens zwischen der 10. und 24. Stunde und spätestens zwischen der 36. und 48. Stunde p.a. unterschritten. Das Unterschreiten der Nachweisgrenze erfolgte frühestens 33,3 Stunden p.a. und spätestens im Zeitraum zwischen der 69. und 94. Stunde. Aufgrund der geringen Anzahl an Probanden und der beachtenswerten Streuung der Ergebnisse sollte keine auf die Gesamtpopulation übertragbare Aussage bezüglich der Ausscheidungszeit getroffen werden.

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Levens, Helga: Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Metamizol hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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