Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit geklonter Schweineembryonen

Sage, Dagmar Theda

The aim of the present study was to improve the developmental potential of porcine nuclear transfer (NT) embryos, in order to reduce the number of NT embryos needed for each recipient and to lengthen the period during which NT embryos can be successfully transferred. An established in vitro culture system used for cloning porcine embryos was modified in two ways. In the first set of experiments; nuclear transfer, IVF and parthenogenetic embryos were cultured in standard NCSU 23 medium under two different oxygen concentrations (5% vs. 20%). In the second set of experiments, all embryos were cultured under 5% oxygen concentration but two different culture media were compared. The first was standard NCSU 23 containing glucose which has been used in the past with some degree of success. The second was a two step procedure in which embryos were first cultured for 58 hours in mNCSU 23 containing lactate and pyruvate but no glucose. After 58 hours, glucose was added to the medium and the embryos were cultured further to the blastocyst stage. Finally, embryos produced by the improved method of in vitro culture were transferred to recipients to determine their developmental competence in vivo. The following results were obtained: A preliminary experiment with parthenogenetic embryos showed that, under a reduced oxygen tension of 5%, the blastocyst rate was improved and the number of nuclei in the blastocysts was increased significantly. In the first main experiment, two different oxygen tensions (5% and 20%) were compared for in vitro culture of NT embryos. The blastocyst rate of nuclear transfer embryos increased significantly under 5% oxygen (19.2%± 8.9 vs. 6.7%± 5.9) and the mean number of blastocyst nuclei increased (25.8± 10.3 vs. 17.7± 12.1). The blastocyst rate of IVF embryos also increased significantly under the lower oxygen tension (30.3%± 6.7 vs. 22.8%± 11.0); and the number of nuclei of these blastocysts showed significant improvement (33.8± 5.0 vs. 27.1± 5.8). The group of the parthenogenetic embryos had a significant increase in blastocyst rate under 5% oxygen (39.0%±10.9 vs. 28.7%± 9.6), as well as a significant increase in the mean cell number of these blastocysts (29.8± 2.5 vs. 25.1± 2.9). Counting the ICM cells and TE cells by differential staining revealed no difference in ICM/TE ratio between the 5% and 20% oxygen cultures for either nuclear transfer derived or parthenogenetic embryos. However, in IVF embryos, the proportion of ICM cells to the total cell number was significantly increased under 5% oxygen (22.6%± 8.3) compared to that of embryos cultured under 20% oxygen (15.6%± 7.4). From the results described above, it is clear that an in vitro culture system based on reduced oxygen concentration significantly improves the developmental rate and embryo quality of porcine embryos from different origins (NT, IVF, parthenogenesis). This can be explained by the fact that the lower oxygen tension is more similar to the physiological conditions found in the mammalian reproductive tract. Embryos which have less oxidative stress species show improved development. The second “main” experiment was a comparison of the previous “standard” embryo culture medium NCSU 23 with a two step method based on modified mNCSU 23. The NT embryos cultured in the two step mNCSU 23 protocol had a significantly higher blastocyst rate than the NT embryos cultured in standard NCSU 23 (31.5%± 11.0 vs. 21.8%± 7.6). However, there was no difference in the mean number of nuclei of blastocysts obtained in the two media and differential staining showed no difference in ICM/TE ratio. After in vitro culture of IVF derived embryos in mNCSU 23, there was no difference from the standard medium with respect to the blastocyst rate, the mean number of nuclei, or the ICM/TE ratio. Comparison of parthenogenetic embryos cultured in the two step mNCSU 23 protocol with those from cultured in the standard NCSU 23 protocol did not show any improvement in blastocyst rate, mean number of nuclei, or ICM/TE ratio. Only NT embryos showed an improvement in in vitro development to the blastocyst stage (blastocyst rate) in the modified NCSU 23 protocol. The quality of these blastocysts, determined as the total number of nuclei and the proportion of ICM cells to the total number of nuclei, was similar to that obtained with standard NCSU 23. IVF derived and parthenogenetic embryos cultured in mNCSU 23 showed no difference with respect to blastocyst rates or the number of nuclei. These results suggest that NT embryos are especially sensitive to glucose during the early embryonic stages (1- to 8-cell embryos). Avoiding glucose during the first stages of embryonic development seems to improve their developmental capacity and appears to improve the outcome of the nuclear reprogramming process. Following the in vitro experiments, embryo transfer experiments were performed using synchronized recipients but no pregnancies could be detected. This could be due to the low number (5) of embryo transfers, the season, the number of embryos transferred to each recipient or to synchronization of the recipient and the transferred embryos but reflect the quality of the transferred NT embryos. It is thus necessary to perform additional in vivo experiments in which some of the above variables are examined. In conclusion, these results indicate that a reduction of the oxygen concentration in the in vitro culture atmosphere increases the blastocyst rate and the quality of embryos produced by either nuclear transfer, IVF or parthenogenetic activation. Modification of the NCSU 23 culture system to provide glucose-free mNCSU 23 for early embryos followed by the addition of glucose on day 3, showed positive effects on the in vitro development of nuclear transfer derived porcine embryos. This improvement of in vitro culture conditions gave a higher yield of NT blastocysts. However, after transfer to synchronized recipients no pregnancy was established. The developmental competence of these blastocysts must be examined further in embryo transfer experiments, including tests with more asynchronous recipients.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Entwicklungspotential porziner Kerntransferembryonen zu verbessern und dadurch die Anzahl zu übertragender Embryonen pro Empfängertier zu reduzieren und die Produktion geklonter Embryonen und den Embryotransfer zeitlich zu entkoppeln. Hierzu wurde die In-vitro-Kultivierung geklonter Schweineembryonen in zwei Versuchsansätzen modifiziert. Im ersten Hauptversuch wurden Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetische Schweineembryonen unter zwei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen (5% vs. 20%) in NCSU 23-Medium kultiviert. Im zweiten Versuchsansatz erfolgte die In-vitro-Kultivierung der Embryonengruppen unter der reduzierten Sauerstoffspannung von 5% vergleichend in zwei Kulturmedien. NCSU 23 diente als glucosehaltiges „Kontrollmedium“, während dem pyruvat- und lactathaltigen mNCSU 23 erst 58 Stunden nach Beginn der Kultur Glucose zugesetzt wurde. Im Anschluss an die In-vitro-Versuche wurden Embryotransfers mit in vitro kultivierten Kerntransfer-Embryonen durchgeführt, um das In-vivo-Potential zu überprüfen. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt. Im Vorversuch wurden unter einer verminderten Sauerstoffkonzentration von 5% eine verbesserte Blastozystenrate bei parthenogenetischen Embryonen sowie eine signifikante Erhöhung der Kernzahlen der Blastozysten erreicht. Im ersten Hauptversuch wurden zwei Sauerstoffspannungen (5% vs. 20%) während der In-vitro-Kultur verglichen. Bei den Kerntransferembryonen waren die Blastozystenraten (19,2%± 8,9 vs. 6,7%± 5,9) sowie die Kernzahlen der Blastozysten (25,8± 10,3 vs. 17,7± 12,1) nach der In-vitro-Kultivierung unter 5% Sauerstoffgehalt signifikant erhöht. Bei den IVF-Embryonen erhöhte sich im ersten Hauptversuch die Blastozystenrate bei der Kultur unter reduziertem Sauerstoff signifikant (30,3%± 6,7 vs. 22,8%± 11,0); die Kernzahlen der Blastozysten zeigten ebenfalls eine signifikante Erhöhung (33,8± 5,0 vs. 27,1± 5,8). Die parthenogenetisch erstellten Embryonen wiesen bei der Kultivierung unter der reduzierten Sauerstoffspannung (5%) eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate (39,0%±10,9 vs. 28,7%± 9,6) auf; die Kernzahlen waren unter diesen Konditionen ebenfalls signifikant erhöht (29,8± 2,5 vs. 25,1± 2,9). Eine Differentialfärbung zur Darstellung der ICM- und TE-Anteile bei Blastozysten aller Embryonengruppen (Kerntransfer, IVF und Parthenogenese) ergab keine Veränderungen zwischen Embryonen aus einer Kultur in 5% oder 20% Sauerstoff, sowohl bei den Kerntransfer- als auch bei den parthenogenetischen Embryonen. Hingegen war bei IVF-Embryonen das Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl bei reduzierter Sauerstoffkonzentration signifikant höher (22,6%± 8,3) als bei unter 20% Sauerstoff kultivierten Embryonen (15,6%± 7,4). Aus oben genannten Ergebnissen wird deutlich, dass eine In-vitro-Kultivierung porziner Embryonen unterschiedlicher Herkunft (Kerntransfer, IVF, Parthenogenese) unter reduziertem Sauerstoff eine signifikante Verbesserung der Entwicklungsraten und Embryonenqualität zur Folge hat. Erklärt werden kann dies damit, dass die reduzierte Sauerstoffspannung die physiologischen Verhältnisse im Reproduktionstrakt von Säugetieren besser simuliert. Die Embryonen sind dem oxidativen Stress durch freie Sauerstoffradikale weniger ausgesetzt, was die frühembryonale Entwicklung fördern kann. Im zweiten Hauptversuch wurde ein modifiziertes Medium (mNCSU 23) mit dem bisherigen Standardmedium (NCSU 23) für die In-vitro-Kultur porziner Embryonen verglichen. Bei der Gruppe der Kerntransferembryonen ergab sich bei der Kultivierung in mNCSU 23 eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate (31,5%± 11,0 vs. 21,8%± 7,6). Die Kernzahlen der Blastozysten zeigten keine Unterschiede zwischen der Kultivierung in NCSU 23 und mNCSU 23; auch die Differentialfärbung ergab bei beiden Kulturmedien ein gleiches Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl. Die Kultivierung der IVF-Embryonen in modifiziertem Medium (mNCSU 23) bewirkte sowohl hinsichtlich der Blastozystenraten als auch bei den Kernzahlen der Blastozysten keine Veränderung. Das Verhältnis der ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl blieb ebenfalls gleich. Die In-vitro-Kultur parthenogenetischer Embryonen in mNCSU 23 ergab im Vergleich zur Kultivierung in NCSU 23 hinsichtlich Blastozystenrate und Kernzahl der Blastozysten keine Verbesserungen, ebenso war das Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl unverändert. Die In-vitro-Kultivierung im modifizierten Kulturmedium mNCSU 23 führte nur bei Kerntransferembryonen hinsichtlich der Blastozystenrate zu einer signifikanten Verbesserung; die in den Kernzahlen und dem Verhältnis von ICM-Zellen zur Gesamtzellzahl gemessene Qualität der Blastozysten war im Vergleich zur Kultur in NCSU 23 gleich. IVF- und parthenogenetisch erstellte Embryonen zeigten in mNCSU 23 keine Veränderung in Blastozystenraten oder Kernzahlen. Deshalb kann vermutet werden, dass Kerntransferembryonen eine besondere Empfindlichkeit gegenüber einer Glucosesupplementierung während der frühembryonalen Stadien (1- bis 8-Zeller) besitzen. Dagegen scheint ein Glucosemangel während der ersten Tage der frühembryonalen Entwicklung einen positiven Einfluss zu haben und auf diese Weise ein ungestörtes „Nuclear Reprogramming“ zu ermöglichen. Bei den im Anschluss an die In-vitro-Versuche durchgeführten Transfers geklonter Embryonalstadien auf synchronisierte Empfängertiere konnten keine Trächtigkeiten etabliert werden. Dies kann einerseits auf die geringe Anzahl (5) der Embryotransfers zurückgeführt werden, andererseits aber auch an der teilweise mangelhaften Qualität der eingesetzten Embryonen liegen. Aus diesem Grund sind weitere In-vivo-Versuche notwendig, bei denen die Empfängersauen außerdem stärker asynchron zu den Embryonen sein sollten. Die Ergebnisse zeigen, dass durch eine Verminderung des Sauerstoffgehalts in der Kulturatmosphäre sowohl die Anzahl produzierter Blastozysten als auch deren Qualität nach Kerntransfer, IVF oder parthenogenetischer Aktivierung verbessert werden kann. Eine Änderung des Kulturmediums NCSU 23 in ein zunächst glucosefreies Medium, dem an Tag 3 Glucose zugesetzt wird, hatte ebenfalls einen positiven Effekt auf die In-vitro-Entwicklung von Kerntransferembryonen. Durch die Verbesserung der In-vitro-Kulturkonditionen kann eine erhöhte Anzahl von Kerntransferembryonen bis zum Blastozystenstadium erzeugt werden. Nach Übertragung auf synchronisierte Empfängertiere gelang es jedoch nicht, eine Trächtigkeit zu etablieren. In weiteren Embryotransferversuchen ist das In-vivo-Entwicklungspotential zu untersuchen, wobei eine stärkere Asynchronität der Empfängertiere zu den Embryonen zu einer erhöhten Effizienz beitragen könnte.

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Sage, Dagmar Theda: Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit geklonter Schweineembryonen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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