Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Das Sommerekzem des Pferdes

Langner, Kathrin Friederike Annika

Summer eczema is one of the most frequent type I allergies in horses worldwide. Affected animals suffer from severe dermatitis located primarily in the mane, withers and base of the tail which leads to serious discomfort. Various hematophagous insects, in particular biting midges of the genus Culicoides, are dominating causes of the disease. The lack of knowledge about responsible allergenic components of midges hampers the elucidation of essential regulatory mechanisms of this type I allergy and, thus, the development of suitable diagnostic and therapeutic regimes. This study describes attempts to identify and characterize potential allergens of Culicoides nubeculosus, the major cause of summer eczema in Germany.    The following results were accomplished:   1. Biochemical characteristics of allergens in a whole body extract of Culicoides nubeculosus A functional in-vitro-test (FIT) was used to monitor allergenic components. The FIT quantifies histamine selectively released from sensitized basophils (besides mast cells the major effector cells in type I allergy) upon triggering with antigen. It was found that at least some of the relevant allergens are hydrophilic proteins and are remarkably stable to degradation. Maximal FIT-activity was seen for proteins with relative molecular masses (Mr) between 44 and 158 kDa and below 17 kDa. The majority of allergens were alkaline.   2. Reactivity of equine serum antibodies and basophils with components in a whole body extract of Culicoides nubeculosus Affinity purified IgE, IgG1 and IgG4 from horses with and without summer eczema were used for immunoprecipitation of components from Culicoides nubeculosus. Predominantly proteins between 15 and 55 kDa came down. Their binding pattern varied depending on the isotype and the allergy status of the serum donating horse. The different antibody isotypes were further used for isolation of soluble components from whole body extract by means of affinity chromatography. Isolated components were subsequently tested in the FIT. FIT positive fractions were separated with IgE from diseased as well as from healthy horses and with IgG4 from allergic animals. However, not enough material could be isolated for more elaborate characterization of these components. In contrast to serum antibodies, exclusively basophils from horses with clinical signs of summer eczema but not from healthy horses recognized components in the whole body extract by means of the FIT.   3. Isolation of potential allergens from a whole body extract of Culicoides nubeculosus      Whole body extract of midges was fractionated by different liquid chromatography procedures. In order to select potential allergens, peak fractions from each chromatography step were monitored by FIT and by immunoblotting. Two dimensional gel electrophoresis and mass-spectrometry were applied to determine some biochemical features of the purified proteins. Combining a strong cation exchange and a reversed-phase column revealed two highly purified proteins subsequently identified as citrate synthase (Mr 45 kDa; isoelectric point (pI) 9,3) and cytochrome c (Mr 15 kDa; pI 9,1).   4. Functional properties of isolated proteins of Culicoides nubeculosus Citrate synthase was unable to induce histamine release from basophils of any of the horses tested in the FIT. Cytochrome c triggered histamine release by basophils of the majority of allergic horses tested. Cells from healthy animals failed to react with the enzyme. In contrast, immunoblotting revealed that citrate synthase and cytochrome c were recognized by IgE, IgG1, IgG4 and IgG5 serum antibodies from horses with and without summer eczema.   In conclusion, citrate synthase does not seem to be involved in summer eczema caused by Culicoides nubeculosus. Cytochrome C, however, may be one potential allergen of these midges. Further experiments, including recombinant expression of the protein and subsequent functional characterization, are required to substantiate the allergenic potential. Comparison of the functional properties of these two proteins documented that in the horse antibody binding alone is not a criterion for allergenic potency of components. The fact that not every horse reacting positively with the whole body extract of Culicoides nubeculosus was FIT positive with cytochrome c indicates that more than one allergen must be involved in the induction of summer eczema.

Das Sommerekzem stellt weltweit eine der häufigsten Typ-I-Allergien des Pferdes dar. Die betroffenen Tiere entwickeln eine schwere Dermatitis, die sich vornehmlich an Mähne, Widerrist und Schweifrübe manifestiert. Als Auslöser der Erkrankung konnten verschiedene haematophage Insekten bestimmt werden, die in erster Linie der Gattung Culicoides (Gnitzen) angehören. Die verantwortlichen Allergene aus den Gnitzen sind unbekannt, so dass eine Klärung der grundlegenden regulativen Mechanismen des Sommerekzems und damit die Entwicklung geeigneter diagnostischer und therapeutischer Maßnahmen bislang nicht erfolgreich war. In dieser Arbeit sollten potentielle Allergene aus der in Deutschland am häufigsten mit dem Sommerekzem assoziierten Gnitzenspezies Culicoides nubeculosus identifiziert und charakterisiert werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Bestimmung biochemischer Eigenschaften von Allergenen im Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus Zum Nachweis der allergenen Potenz der Gnitzen-Komponenten wurde ein funktioneller In-vitro-Test (FIT) angewandt. Im FIT wird die Aktivierung sensibilisierter basophiler Granulozyten (neben Mastzellen die Haupteffektorzellen der Typ-I-Allergie) nach Antigenstimulation anhand der Histaminfreisetzung erfasst. Es konnte festgestellt werden, dass zumindest ein Teil der Allergene aus Culicoides nubeculosus hydrophil ist, über ein hohes Maß an Stabilität verfügt und zur Substanzklasse der Proteine gehört. Die höchste Reaktivität im FIT wurde durch Proteine der Molmassen zwischen 44 und 158 kD sowie < 17 kD erzielt. Ein Großteil der Allergene ist basischer Natur.   2. Reaktivität von equinen Serum-Immunglobulinen und basophilen Granulozyten mit den Komponenten des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus   Affinitätsgereinigtes IgE, IgG1 und IgG4 aus dem Serum von Pferden mit und ohne Sommerekzem wurde zur Immunpräzipitation von Culicoides-Komponenten eingesetzt. Die genannten Isotypen detektierten vorrangig Gnitzenproteine mit relativen Molmassen (Mr) zwischen 15 kD und 55 kD. Das Bandenmuster der Komponenten variierte sowohl in Abhängigkeit vom Isotyp als auch vom Allergiestatus der Pferde. Die equinen Immun-globuline wurden weiterhin zur Affinitätschromatographie verwendet. Dadurch konnten die von den Antikörpern gebundenen Gnitzenproteine in löslicher Form isoliert und nachfolgend im FIT hinsichtlich ihrer Reaktivität mit equinen basophilen Granulozyten untersucht werden. FIT-positive Komponenten wurden sowohl durch das IgE ekzemkranker und gesunder Pferde als auch durch das IgG4 der allergischen Tiere erhalten. Die Mengen der gewonnenen Proteine reichten jedoch für weiterführende Untersuchungen nicht aus. Im Gegensatz zu den Serum-Immunglobulinen reagierten ausschließlich die basophilen Granulozyten der ekzemkranken Pferde, nicht aber der gesunden Kontrolltiere, mit den Komponenten des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus bei der Untersuchung im FIT.   3. Isolierung potentieller Allergene des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus Der Extrakt wurde durch flüssigkeitschromatographische Verfahren fraktioniert, bis einzelne Proteine vorlagen. Um eine gezielte Reinigung potentieller Allergene zu erreichen, wurden nach jedem Chromatographieschritt die erhaltenen Fraktionen im FIT und im Immunoblot überprüft. Die gereinigten Proteine wurden in der zweidimensionalen Gelelektrophorese und in der Massenspektrometrie hinsichtlich ausgewählter biochemischer Parameter charakterisiert. Durch die Kombination eines starken Kationenaustauschers mit der Reversed-Phase-Chromatographie konnten zwei Kandidatenallergene isoliert werden, die als Citratsynthase (Mr 46,5 kD; isoelektrischer Punkt (pI) 9,3) und Cytochrom C (Mr 14,6 kD; pI 9,1) identifiziert wurden.   4. Funktionelle Eigenschaften der isolierten Proteine aus Culicoides nubeculosus     Die Citratsynthase induzierte im FIT keine Histaminfreisetzung aus den equinen basophilen Granulozyten. Für das Cytochrom C konnte dagegen bei der Mehrzahl der untersuchten allergischen Pferde eine Histaminfreisetzung aus den Zellen nachgewiesen werden. Die basophilen Granulozyten der gesunden Kontrolltiere reagierten nicht auf das Enzym. Dagegen konnten im Immunoblot Antikörper der Isotypen E, G1, G4 und G5 im Serum von Pferden mit und auch ohne Sommerekzem nachgewiesen werden, welche die beiden isolierten Proteine detektierten.   Schlussfolgernd ist für die Citratsynthase eine Beteiligung an dem durch Culicoides nubeculosus verursachten allergischen Geschehen des Sommerekzems unwahrscheinlich. Im Gegensatz dazu kann das Cytochrom C als ein potentielles Allergen aus den Gnitzen angesehen werden. Für einen abschließenden Beweis der allergenen Wirksamkeit des Enzyms ist eine rekombinante Expression mit nachfolgender Charakterisierung notwendig. Durch den Vergleich der funktionellen Eigenschaften der beiden isolierten Proteine wurde deutlich, dass beim Pferd die Bindung durch Serum-Immunglobuline alleine keine zuverlässige Aussage über die allergene Potenz einer Komponente erlaubt. Neben dem Cytochrom C ist noch mindestens ein weiteres Allergen an der Ausprägung des Sommerekzems beteiligt, da bei allen getesteten ekzemkranken Pferden positive FIT-Resultate mit dem Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus erzielt wurden, jedoch nur bei einem Teil der Tiere mit dem Cytochrom C.

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Langner, Kathrin Friederike Annika: Das Sommerekzem des Pferdes. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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