Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Pharmakologische Beeinflussung der Bronchokonstriktion an "Precision Cut Lung Slices" (PCLS) beim Pferd

Barton, Ann Kristin

The aim of the study was to upgrade the technique to produce Precision Cut Lung Slices from equine lung tissue established by VIETMEIER (2004), which was used to test and compare several bronchoconstrictive substances. The lungs from 27 horses were used in the study. Seven lungs were needed for learning and upgrading the technique, the others served their purpose in pre- and main experiments. Before the horses were euthanized, a clinical examination, an examination of the respiratory tract, an arterial blood gas analysis, a bronchoscopy and an analysis of aspirated tracheobronchial secrete were performed. The results of these examinations were graduated in view of severeness of COB (chronic obstructive bronchitis) using a score-system (OHNESORGE et al, 1998). Immediately post mortem, the lobus accessorius was taken out. It was stored on ice in sterile saline (0,9%) until production of PCLS began. Furthermore, tissue samples were taken from lobus cranialis, caudalis and accessorius of the right lung. They were fixated in formaldehyde solution (10%) and were examined for histo-diagnosis. The PLCS of 250 μm thickness were incubated under cell culture conditions at 37°C. After medium had been changed several times, the vitality was evaluated under the microscope in regard of cilia movement and contraction after increasing concentrations of bronchoconstrictors acetylcholine, metacholine (project 1) or histamine (project 2) were added. By changing the medium several times, the bronchial tubes reopened again. Then the PCLS of project 1 were incubated for 20 minutes in a constriction inhibiting solution of cilomilast (10-5 mol/L), atropine, ipratropiume or tiotropiume (10-7 mol/L). Afterwards they were faced again with increasing concentrations of the former bronchoconstrictor (10-8 bis 10-4 mol/L). After a further reopening, a post-constriction was triggered without a constriction inhibitor.  Photographs were taken of the PCLS’ reaction to examine changes in the bronchial cross-section, which were analysed digitally. Each experiment was performed using 2-3 PCLS and there was also a control group of 2-5 PCLS, which were tested at the same time. In project 2, PCLS were incubated in a solution of diphenhydramine (10-6 mol/L) or azelastine (10-11 mol/L) and the bronchoconstriction was triggered by histamine. Further details were the same as in project 1. A significant difference between pre-contraction (without constriction inhibitor) and main contraction (after incubation in inhibitor) was found for atropine, ipratropiume and tiotropiume, whereas there was no difference in cilomilast and the control groups.  Statistic analysis of dissemination showed big interindividual differences between single subjects. In contrast to this, there was no significant difference between single PCLS of the single horse. Histamine caused a measurable bronchoconstriction in horses suffering from severe COB only, whereas data from healthy horses or those suffering from mild forms of COB did not reveal any measurable reaction, and consequently no statistic analysis was possible. There was no relation found between the results of histo-diagnosis and the PCLS’ reagibility in projects 1 or 2. In this study, basic scientific findings on hyperreagibility and the influence on reagibility through several pharmacons were found for PCLS of the horse. This technique allows the assessment of different substances in a single subject, and thus it increases the possibility to compare results and decreases the number of animals needed for these studies.

Ziel dieser Arbeit war es, die von VIETMEIER (2004) etablierte Technik zur Gewinnung von Precision Cut Lung Slices (PCLS) aus equinem Lungengewebe weiterzuentwickeln und mittels dieser Methode verschiedene hemmende Substanzen der Bronchokonstriktion vergleichend zu untersuchen. Lungen von 27 Pferden wurden in der Studie verwendet. Sieben Lungen dienten dem Erlernen und der Verbesserung der Methodik, die restlichen Lungen fanden in Vor- und Hauptversuchen Verwendung. Vor der Euthanasie fanden eine Allgemeinuntersuchung, eine spezielle Untersuchung der Atemwege, eine arterielle Blutgasanalyse, eine Bronchoskopie und eine Tracheobronchialsekretanalyse statt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden mittels des Score-Systems nach OHNESORGE et al. (1998) hinsichtlich des Erkrankungsgrades an chronisch obstruktiver Bronchitis (COB) ausgewertet. Unmittelbar post mortem folgte die Entnahme des Lobus accessorius, der auf Eis in steriler Kochsalzlösung gelagert wurde und kurz darauf der Erstellung der PCLS diente. Außerdem wurden Gewebeproben aus Lobus cranialis, caudalis und accessorius der rechten Lunge. entnommen. Diese wurden in 10%igem Formalin fixiert und histopathologisch untersucht. Die 250 μm dicken PCLS wurden unter Zellkulturbedingungen bei 37°C inkubiert. Nach mehreren Medienwechseln wurde die Vitalität anhand des Zilienschlags des Flimmerepithels und der Kontraktionsfähigkeit auf steigende Konzentrationen der Bronchokonstriktoren Acetylcholin oder Metacholin (Reihe 1) bzw. Histamin (Reihe 2) mikroskopisch beurteilt.  Nach mehreren Medienwechsel fand eine Wiederöffnung des Bronchuslumens statt.  Die Schnitte der Reihe 1 wurden dann für zwanzig Minuten in einer konstriktionshemmenden Cilomilast- (10-5 mol/L), Atropin-, Ipratropium-, oder Tiotropiumlösung (10-7 mol/L) inkubiert und anschließend noch einmal aufsteigenden Konzentrationen des jeweiligen Bronchokonstriktors (10-8 bis 10-4 mol/L) ausgesetzt. Nach erneuter Wiederöffnung wurde noch einmal eine Nachkontraktion ohne Konstriktionshemmer ausgelöst, um die Vitalität der PCLS bis Versuchsende sicherzustellen. Die Reaktion der Schnitte in Bezug auf Änderungen des Bronchusquerschnittes wurde fotografiert und digital ausgewertet. Parallel zu den Versuchen (Doppelt- bis Dreifachansatz) wurden jeweils 2-5 PCLS als Kontrollgruppe mituntersucht. In Reihe 2 wurden die PCLS in Diphenhydramin (10-6 mol/L) bzw.  Azelastin-Lösung (10-11 mol/L) inkubiert, als Bronchokonstriktor diente hier Histamin, im weiteren entsprach die Versuchsdurchführung der der Reihe 1. Für Atropin, Ipratropium und Tiotropium konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Präkontraktion (ohne Hemmer) und Hauptkontraktion (mit Hemmer) nachgewiesen werden, für Cilomilast und die Kontrolle hingegen nicht. Die statistische Streuungsanalyse zeigte den großen interindividuelle Unterschied zwischen den einzelnen Probanden auf. Im Gegensatz zum intraindividuellen Unterschied zwischen den einzelnen PCLS war dieser z.T. hoch- bis höchstsignifikant. Durch Histamin konnte nur bei PCLS von mittel- bis hochgradig erkrankten Pferden eine auswertbare Bronchokonstriktion ausgelöst werden, nicht aber an PCLS von gesunden bzw. geringgradig erkrankten Probanden. Eine statistische Auswertung war daher nicht möglich.  Es ergab sich kein Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der histopathologischen Untersuchung und den Reaktionen der PCLS in den Versuchsreihen 1 und 2. In der vorliegenden Studie wurden grundlegende Erkenntnisse zur Hyperreagibilität und Beeinflussung der Reagibilität durch verschiedene pharmakologische Substanzen an PCLS des Pferdes erarbeitet. Die Methodik erlaubt die Untersuchung mehrerer Substanzen an einem Probanden, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erhöht und die Anzahl erforderlicher Tierversuche verringert.

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Barton, Ann Kristin: Pharmakologische Beeinflussung der Bronchokonstriktion an "Precision Cut Lung Slices" (PCLS) beim Pferd. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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