Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The physiological site of action and the site of resistance to the macrocyclic lactone anthelmintics in sheep parasitic trichostrongyloid nematodes

Demeler, Janina

Resistance to the macrocyclic lactone (ML) group of anthelmintics threatens several animal industries worldwide and is also a potential problem in humans. In order to understand resistance processes and develop tests for resistant worms we need a better understanding of the mechanism of ML action. ML's are thought to act by inhibiting the somatic and/or the pharyngeal musculature. However, it still remains unknown, which site of action might be the more sensitive and/or important one in regards to development of resistance. In this study several techniques were used to measure the effects of six different ML’s on these tissues in the three economical important sheep parasitic nematodes Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis and Telodorsagia circumcincta. Larvae and adult worms were used, to be able to evaluate differences between the various life cycle stages. This work is also relevant to studies that aim to localise the expression of genes that are linked to resistance. Another aim of this work was the detection of possible differences in resistance levels between the two groups of ML’s, the avermectins and milbemycins. Of special interest was the resistance status against MOX, a milbemycins which is used in the field to control ivermectin-resistant isolates. The present study revealed that appearance of resistance to ML anthelmintics differs between the two sites tested (pharynx vs. somatic muscles) and also changes with the life cycle stage of the parasites (larvae vs. adult). The larval development assay (LDA, likely to measure pharyngeal physiology) observed that susceptible Haemonchus, Trichostrongylus and Telodorsagia were 2-30 fold more sensitive to ML’s than resistant worms of the same species. These data suggest that the pharynx is an important site of ML action and resistance in the larvae of these parasites. In the Larval Migration Inhibition Assay (LMIA, likely to measure somatic muscle physiology) the larvae of the susceptible isolates of all three species were significantly less sensitive (100-500 fold) than observed in the LDA. The resistant isolates only generated significant differences in the EC50 values than the susceptible isolate for MOX (H. contortus and T. colubriformis 7-8 fold / T. circumcincta 22 fold). These findings indicate that the pharynx is likely to be the more sensitive site of action in larval stages.  The Micromotility Meter (MM) measures effects on the somatic body muscles in parasitic stages. In the present study it was successfully adapted to the use of adult T. colubriformis and T. circumcincta. The adult worms were intact and not preparated in any way. The adult worms of both tested species were found to be sensitive towards extremely lower concentrations (2,000 - 5,000 fold) of the tested anthelmintics than found with their larval stages tested in the LMIA. The Electropharyngeogram (ELPG) measures the effects on pharyngeal pumping. It was shown that ML’s generate a dose-dependent reaction on pharyngeal pumping of T. colubriformis. In adult T. colubriformis inhibition of pharyngeal pumping (in up to 10 minutes) was only achieved at higher concentrations (10 fold difference) than inhibition of motility in the MM. But the results of T. colubriformis in the ELPG were similar to the results obtained in the LDA. This indicates a good correlation between the two assays and little or no changes through the life cycle in regards to this site of action. It also raises the question, which structures in an intact worm are limiting, critical or important in any other way for the development of resistance. The Muscle Transducer (MT) measures the response of somatic body musculature to anthelmintics. In adult H. contortus inhibition of muscle contraction was achieved at concentrations ~1000 fold lower than in the LMIA. Wether these differences are due to changes in the life cycle or different approach of the site by the drug still remains unknown. But overall the somatic muscles seem to be an important site of action in the parasitic stages of this isolate. The results of the MM and the MT also indicate that the LMIA is not useful for detecting anthelmintic resistance status in adult parasitic stages. For most of the tested anthelmintics the LMIA was not able to detect the differences in resistance ratios between the susceptible and resistant isolate. The results in the present study revealed a drastic change in sensitivity between larval and parasitic stages. It suggests that the site of action in the somatic muscle is the more sensitive one in parasitic stages while in larval stages the pharynx is more sensitive. These findings are in contrast to the results obtained previously. Future research should concentrate on work at intact parasitic stages rather than non-parasitic stages to obtain more comparable results. Furthermore the results of all chapters support previous findings of a similar mechanism and site of action for IVM and MOX. Even with MOX mostly being the most efficient drug, resistance was detected for all species in almost every experiment. Rajan (RANJAN et al., 2002) demonstrated, that in H. contortus resistance to IVM result in resistance to MOX and vice-verca. The fact, that resistance to MOX was found in all experiments and isolates in this study indicates, that resistance to MOX develops, just in a more slowly process.

Resistenzen gegen die die Anthelmintika-Gruppe der Makrozyklischen Laktone (ML) bedrohen Tierhaltungs- und Fleischindustrien weltweit und sind ebenso ein potentielles Problem beim Menschen. Um den Prozess der Resistenzentwicklung besser untersuchen und verstehen zu können und um bessere Detektionsmethoden entwickeln zu können, ist die Kenntnis des Resistenzmechanismus wichtig. Makrozyklische Laktone wirken durch die Inhibition von somatischer und/oder pharyngealer Muskulatur. Aber es ist nach wie vor nicht genau bekannt, welche dieser beiden Wirkorte der sensitivere und/oder wichtigere von beiden in diesem Prozess ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden entwickelt und benutzt, um den Effekt von sechs verschiedenen ML’s an somatischer und pharyngealer Muskulatur zu messen. Hierfür wurden die drei ökonomisch bedeutendsten Nematoden des Schafes, Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis und Telodorsagia circumcincta gewählt. Es wurden sowohl Larven als auch adulte Stadien getestet, um mögliche Unterschiede innerhalb des Entwicklungszyklusses zu berücksichtigen. So konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von Resistenzen gegen ML’s an den zwei getesteten Wirkorten (Pharynxmuskulatur und somatische Muskulatur) unterschiedlich ist und sich außerdem innerhalb des Lebenszyklusses der Parasiten ändert. Der in der Arbeit verwendete Larven-Entwicklungs-Hemmtest (LDA, misst vermutlich die physiologische Aktivität der Pharynxmuskulatur) hat ergeben, dass empfindliche Haemonchus, Trichostrongylus und Telodorsagia Isolate 2-30 fach empfindlicher gegen die getesteten ML’S waren als resistente Isolate der selben Spezies. Diese Daten sprechen dafür, dass die Pharynxmuskulatur ein wichtiger Reaktionspunkt für die ML’s ist und bei diesen Parasiten ebenso eine wichtige Rolle in der Resistenzentwicklung spielt. Im Larven-Migrations-Hemmtest (LMIA, misst vermutlich physiologische Aktivität der somatischen Muskulatur) waren die Larven der empfindlichen Isolate aller drei Spezies signifikant weniger empfindlich (100-500 fach) als im LDA. Hinsichtlich der EC50-Werte von resistenten und empfindlichen Isolaten zeigte sich nur bei MOX ein signifikanter Unterschied (H. contortus and T. colubriformis 7-8 fach / T. circumcincta 22 fach). Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass gegenüber der somatischen Muskulatur der Pharynx der empfindlichere Wirkort in larvalen Stadien ist. Das Micromotility Meter (MM) misst den Effekt der Anthelmintika an der somatischen Muskulatur. In der vorliegenden Arbeit konnte die für Larven entwickelte Methode erfolgreich für adulte Stadien von T. colubriformis und T. circumcincta adaptiert und standardisiert werden. Die adulten Würmer beider Spezies zeigten sich empfindlicher gegen extrem niedrigere Konzentrationen (2,000 – 5,000 fach) der getesteten ML’s als ihre larvalen Stadien im LMIA. Das Elektropharyngeogram (ELPG) misst die Effekte von Anthelmintika an der Pharynxmuskulatur (pharyngeal pumping).Es konnte gezeigt werden, das MLs eine dosis-abhängige Reaktion am Pharynx hervorrufen. In adulten T. colubriformis konnte eine Hemmung der Pharynxmuskulatur und dessen Pumpaktivität (innerhalb von 10 Minuten) nur in Konzentrationen erzielt werden, welche etwa um eine Zehnerpotenz höher waren als die, die zur Hemmung der Motilität im MM verwendet wurden. Die Ergebnisse von T. colubriformis im ELPG waren ähnlich der, welche auch im LDA erzielt wurden. Dies lässt erstens darauf schliessen, dass eine gute Korrelation zwischen den beiden genannten Testverfahren besteht und zweitens, dass sich die Empfindlichkeit der pharyngeale Strukturen gegenüber ML’s innerhalb des Entwicklungszyklusses nicht oder nur wenig verändern. Sie werfen dabei auch die Frage auf, welche der Strukturen des Pharynx in einem intakten Wurm limitierend, kritisch oder in sonst irgendeiner Weise wichtig  für die Resistanzentwicklung sind. Der Muscle-Transducer (MT) misst die Reaktion der somatischen Körpermuskulatur auf Anthelmintika. In adulten H. contortus konnte die vollständige Hemmung der Muskelkontraktion auch noch bei Konzentrationen erreicht werden, welche ca. 1000 fach niedriger waren als die im LMIA verwendeten Konzentrationen. Ob diese großen Differenzen auf Unterschiede innerhalb des Entwicklungszyklusses zurückzuführen sind oder aufgrund der unterschiedlichen Applikation des Anthelmintikums entstehen ist noch nicht hinreichend geklärt. Grundsätzlich kann aber gefolgert werden, dass auch die somatische Muskulatur ein sehr wichtiger Wirkungsbereich für ML’s in adulten Parasiten von Haemonchus ist. Die Ergebnisse des MM und des MT lassen ebenfalls darauf schliessen, dass das LMIA keine sinnvolle Methode ist, um Resistenzen gegen ML’s zu testen. Nicht nur die verwendeten Konzentrationen sind um ein Vielfaches höher zu wählen. Auch die RR (resistance ratio) ist signifikant verschieden. Die Ergebnisse in der vorliegenden Studie zeigen drastische Unterschiede in der Sensitivität gegenüber MLs zwischen larvalen und adulten Stadien der untersuchten Parasiten. Dies lässt darauf schliessen, dass der Wirkungsort in der somatischen Muskulatur in adulten Würmern der empfindlichere ist, während in larvalen Stadien die Pharynxmuskulatur empfindlicher ist. Diese Ergebnisse widersprechen zum Teil bisher veröffentlichen Ergebnissen und der Annahme, dass die Pharynxmuskulatur empfindlicher ist als die somatische Muskulatur. Ähnliche vergleichende Studien von empfindlichen und resistenten Trichostrongyliden in verschiedenen Entwicklungsstadien bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber MLs sind bisher noch nicht publiziert worden. Da sehr wahrscheinlich ist, dass sich innerhalb des Entwicklungszyklusses erhebliche Unterschiede in der Sensitivität gegenüber ML’s entwickeln, ist es ratsam, zukünftige physiologische Resistanzforschung und –prüfung an intakten adulten Würmern voranzutreiben um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Ausserdem aber unterstützen die Ergebnisse aller Untersuchungsmethoden die Theorie, dass IVM und MOX einen ähnlichen Wirkungsmechanismus und auch einen ähnlichen Wirkungsort haben. Auch wenn MOX das wirksamste der hier untersuchten ML’s ist, konnten für alle drei Spezies beginnende oder vorhandene Resistenzen entdeckt werden. Die Tatsache, dass Resistenzen gegen MOX bei allen Experimenten und allen Spezies in der Studie gefunden wurden legt nahe, dass Resistenzen gegen MOX sich ebenso entwickeln wie gegen IVM, der Prozess aber langsamer vor sich geht.

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Demeler, Janina: The physiological site of action and the site of resistance to the macrocyclic lactone anthelmintics in sheep parasitic trichostrongyloid nematodes. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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