Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Erste Schritte zum Nachweis antigen-spezifischer zellulärer Immunantworten gegen das E7-Protein des bovinen Papillomvirus Typ 1 beim Pferd

Gutmann, Sabine

The equine sarcoid is a semimaligne skin tumor in horses, mules and donkeys that is caused by an infection with the bovine papillomavirus (BPV) type 1 or 2. A therapeutic vaccine based on BPV 1-L1/E7-chimeric virus like particles (CVLPs) was developped in a former work. This vaccine should be able to activate tumorantigen-specific cytotoxic T cells (CTLs). To proof if the CVLPs are able to generate a cytotoxic T cell response in vaccinated horses in this work first steps to develop an assay should be done. This assay is based on IFN-g production by CD8-positive cytotoxic T cells induced by antigen. This is possible by using the IFN-g ELISPOT assay and / or the intracellular cytokine staining. For this reason different monoclonal antibodies (mabs) against the eqIFN-g protein were generated. To set up an ELISPOT assay almost one ab-pair was needed that has to be able to detect different epitopes on the IFN-g protein. In the first step three independent antibody clones rat anti-eqIFNg mabs were produced. Using a sandwich-ELISA (SW-ELISA) for the quantification of the eqIFN-g protein it became clear that the abs probably detect the same epitope of the eqIFN-g protein. This led to the development of mouse anti-eqIFN-g mabs that were able to bind different epitopes on the eqIFN-g protein. One antibody pair of the mouse anti-eqIFN-g mabs was used to develop a SW-ELISA to quantify eqIFN-g specifically with a detection limit of 2 ng/µl. In the neutralisation assay by using the Vesiculostomatitis virus (VSV) on an equine (E.derm) and a bovine (MDBK) cell line the IFN-g neutralising capacity of the mabs was prooved. It was possible to show that eqIFN-g in contrast to IFN-a shows a high species specifity and that its antiviral effect depends upon glycosylation of the protein. Unfortunately, it was not possible to set up an ELISPOT assay with the available abs. But they were able to detect intracellular equine IFN-g in CD8-positive and CD8-negative equine T-lymphocytes after stimulation with mitogen using indirect immunofluorescence and flow cytometry. This was possible using freshly isolated and cryoconserved equine lymphocytes. Even if first tries with 3 horses to show CD8 T cells specific for BPV1-L1/E7 were not succesful first steps are now done to proove antigen-specific T cell reactions with the developped and characterized monoclonal antibodies.

Das equine Sarkoid ist ein semimaligner Hauttumor bei Pferden, Eseln und Maultieren, der durch die Infektion mit bovinem Papillomvirus (BPV) Typ 1 oder 2 hervorgerufen wird. Zur Therapie dieser Tumore ist ein Impfstoff basierend auf BPV 1-L1/E7-chimären Virus-ähnlichen Partikeln (CVLPs) entwickelt worden. Eine therapeutische Vakzine muß in der Lage sein, tumorantigen-spezifische T-Zellen zu induzieren. Um überprüfen zu können, ob die CVLPs eine zytotoxische T-Zell-Reaktion bei immunisierten Pferden auslösen können, sollte in der vorliegenden Arbeit auf die Entwicklung eines Verfahrens hingearbeitet werden, mit dem antigen-spezifische zytotoxische T-Zell-Reaktionen bei Pferden gemessen werden können. Der zu entwickelnde Test basiert auf der durch Antigen induzierten  IFN-g Produktion von CD8 positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs). Dieses sollte mittels IFN-g-ELISPOT-Verfahren und / oder intrazellulärem IFN-g-Nachweis möglich sein. Deshalb wurden zunächst verschiedene monoklonale Antikörper (mAK) gegen das equine IFN-g (eqIFN-g) Protein hergestellt. Für die Entwicklung des ELISPOT-Verfahrens wurde mindestens ein Antikörperpaar benötigt, das unterschiedliche Epitope des eqIFN-g Proteins erkennt. Zu diesem Zweck wurden im ersten Schritt von drei voneinander unabhängigen Rattenhybridomklonen Antikörper gegen eqIFN-g produziert. Damit wurde ein Sandwich-ELISA-System etabliert. Dabei zeigte sich, dass vermutlich die 3 monoklonalen Rattenantikörper dasselbe Epitop auf dem IFN-g-Protein erkennen. Dies führte zur Entwicklung von Maus anti-eqIFN-g mAK, die unterschiedliche Epitope auf eqIFN-g binden. Mit einem Antikörperpaar der Maus anti-eqIFN-g mAKs wurde ein Sandwich-ELISA zur spezifischen Quantifizierung von eqIFN-g mit einer unteren Nachweisgrenze von 2ng/µl entwickelt. Im Neutralisationstest unter Verwendung des Vesikulostomatitis Virus (VSV) auf der der Pferdezelllinie (E.derm) und den bovinen Zellen (MDBK) konnte nicht nur die IFN-g neutralisierende Kapazität der mAk geprüft werden. Es zeigte sich auch, dass im Gegensatz zu IFN-a das eqIFN-g über eine hohe Speziesspezifität verfügt und in seiner antiviralen Wirkung von seiner Glykosylierung abhängig ist. Die Etablierung eines IFN-g ELISPOT-Verfahrens gelang mit den zur Verfügung stehenden Antikörpern leider nicht. Dafür waren sie aber geeignet intrazellulär equines IFN-g bei CD8-positiven wie bei CD8-negativen equinen T-Lymphozyten nach ausreichender Mitogenstimulation mit Hilfe von indirekter Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie nachzuweisen. Dies gelang sowohl bei frisch isolierten wie bei kryokonservierten equinen Lymphozyten. Auch wenn orientierende Versuche an 3 Pferden zum Nachweis von CD8 T-Zellen mit Spezifität für BPV 1-L1/E7 nicht erfolgreich waren, so sind für derartige Prüfungen antigenspezifischer T-Zellreaktionen mit den hier entwickelten und charakterisierten mAk samt der Darstellung möglicher Verfahren erste weiterführende Schritte getan.

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Gutmann, Sabine: Erste Schritte zum Nachweis antigen-spezifischer zellulärer Immunantworten gegen das E7-Protein des bovinen Papillomvirus Typ 1 beim Pferd. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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