Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulare Charakterisierung der porcinen Spermadhäsin Gene

Haase, Bianca

The pig belongs to one of the most important economic animal species world-wide. This causes further interest in achieving improved fertility in these animals.  Analyses of the porcine spermadhesins have proven their great influence during fertilisation. Their immunmodulating effect inside the uterus is just as important as the formation of the oviduct sperm reservoir and the interaction between sperm and zona pellucida. The objective of this study was to investigate full-length cDNA sequences of the five porcine spermadhesins for the first time. With the aid of a mutation analysis and an expression study the importance of the spermadhesin genes for porcine fertilisation should be find out. Additionally the DMBT1 gene was analysed as the selected clones coincidently contained the sequence. The genomic sequence of the spermadhesin genes was already submitted before this analysis started. To obtain full-length cDNA sequences ESTs from databases were aligned with self generated 5'‑RLM-RACE sequences. The mutation analysis as well as the expression study entailed more trouble than supposed due to segmental duplication within the five spemadhesins. There was no possibility of amplifying specific products. Noted expressions in different tissue localizations could be confirmed. Yet, these results cannot lead to any statement about the expression levels caused by the described experimental troubles. Nevertheless, they made it possible to receive an impression of the evolution of the porcine spermadhesin genes. Keeping the high homology between the porcine spermadhesin genes in mind it seems to be possible that the five genes developed through segmental duplication of one original gen. The human DMBT1 gene with its 55 exons seems to be a candidate tumour suppressor gene. After alignment of the RACE sequences with EST database sequences, full-length cDNA was equalized against the porcine BAC and PAC clone sequence. These experiments come to the conclusion that pigs have a decreased number of exons, that is to say 28, compared with the human orthologe. In comparison with the BAC/PAC clone DNA, the self generated cDNA of the second pig contained additional sequences. An InDel polymorphism might be a possible explanation to this phenomenon because the additional cDNA sequence is equivalent to the high repetitive part of the DMBT1 gene.

Das Schwein ist eine Tierart mit großer wirtschaftlicher Bedeutung. Bisherige Untersuchungen an den Spermadhäsinen haben gezeigt, dass sie eine wichtige Funktion während der Befruchtung im weiblichen Genital übernehmen. So haben sie im Uterus einerseits eine immunmodulatorische Wirkung, andererseits spielen sie eine wichtige Rolle bei der Bildung des Spermienreservoirs und bei der Bindung der Spermien an die Zona pellucida. Ziel dieser Arbeit war es erstmals die vollständigen cDNA Sequenzen der fünf porcinen Spermadhäsine zu ermitteln. Eine Mutationsanalyse und eine Expressionsstudie sollten weitere Erkenntnisse über die Bedeutung der Spermadhäsine für die Befruchtungsleistung beim Schwein liefern. Zusätzlich sollte das auf den ausgewählten Klonen befindliche DMBT1 Gen analysiert werden. Zu Beginn der Arbeit lagen die genomischen Sequenzen der Spermadhäsine bereits vor. Um Volllänge-cDNAs zu gewinnen, wurden die in den Datenbanken eingetragenen ESTs mit eigenen Sequenzen aus einer 5′-RLM-RACE zu einer Volllänge-cDNA zusammengefügt. Die Mutationsanalyse sowie die Expressionsuntersuchung gestalteten sich schwieriger als erwartet. Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmungen durch segmentale Duplikation der fünf Spermadhäsine untereinander war es nicht möglich, spezifische Produkte zu amplifizieren. Durch die Expressionsstudie konnten die bereits beschriebenen Gewebe mit ihren Expressionen bestätigt werden, eine Aussage über die Quantität war aufgrund der experimentellen Schwierigkeiten nicht zu machen. Jedoch gestatten die Ergebnisse einen Einblick in die Evolution der porcinen Spermadhäsingene. Aufgrund ihrer Homologie erscheint es wahrscheinlich, dass die hohe Anzahl an Spermadhäsingenen beim Schwein durch mehrfache Duplikation bereits vorhandener Sequenzen entstanden ist. Das humane DMBT1 Gen mit seine 55 Exons stellt beim Menschen ein Kandidatengen für ein Tumor-Supressor‑Gen dar. In dieser Arbeit wurde durch die Verknüpfung von RACE Sequenzen mit EST Datenbankeinträgen eine Volllänge-cDNA erstellt, die mit den ermittelten genomischen Sequenzen der porcinen BAC- und PAC-Klone verglichen wurde. Dabei stellte sich heraus, dass es beim Schwein im Vergleich zum Menschen eine geringere Anzahl Exons gibt. So konnten auf dem BAC Klon 28 Exons ermittelt werden. Die selbst generierte DMBT1 cDNA von einem anderen Schwein enthielt zusätzliche Sequenzen, die auf dem genomischen BAC-Klon nicht kodiert waren. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre ein InDel‑Polymorphismus, da die zusätzliche cDNA-Sequenze genau einer Einheit im hochrepetitiven Teil des DMBT1 Gens entspricht.

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Haase, Bianca: Molekulare Charakterisierung der porcinen Spermadhäsin Gene. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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