Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Transportverhalten natürlich vorkommender und künstlich generierter Mutationen intestinaler Enzyme in polaren und unpolaren eukaryotischen Zellen

Keiser, Markus Wolfdiedrich Bernard

The exploration and comprehension of intracellular protein transport mechanisms resulted already in the past in the development of various pharmaceuticals. The quality of life at patients suffering from diseases based on a protein defect could be improved. Most decisive in this context was the knowledge that could be derived from naturally occurring protein mutants. By observing differences in the folding and thereby an associated change in activity, mechanisms could be characterized which are taking effect on the protein sorting of proteins within a cell. Since a lot of questions are still unanswered, it is of prime importance to further this branch of research. Therefore, in this work naturally occurring mutations of the sucrase-isomaltase (SI) were analyzed as well as an artificially generated mutation of the lactase-phlorizin hydrolase by biochemical and cell biological techniques. To identify SI-mutants blood or biopsies of the small intestine were taken from eleven patients showing the symptoms of congenital sucrase-isomaltase deficiency (CSID). From one biopsy specimen cDNA was extracted by RT-PCR. The genomic DNA was isolated from all blood specimens. The coding region of SI was then amplified by PCR and sequenced. By this method two significant mutations were detected within the cDNA of one patient leading to an amino acid exchange.  The first mutation results in an exchange of aspartic acid to asparagine at position 366 in the amino acid sequence. This mutation was not further investigated because a similar polymorphism (Q1203E) has been previously described and an in silico assay did not indicate significant changes in the protein structure. The second mutation was localized in the isomaltase subunit and led to an exchange of cysteine to argenine (C635R). This mutation was inserted into the wildtype SI by site-directed mutagenesis. In vitro the protein shows a decelerated nondirectional transport to the apical and basolateral membrane, only a faint complex glycosylation and an accumulation in the endoplasmatic reticulum (ER). Because of this phenomenon a seventh phenotype, showing similarities to the phenotypes 2 and 4, could be described for the CSID. Moreover, this mutation shows that apically and basolaterally transported proteins are already sorted in the ER by an association with Tween20-resistant microdomains. The genomic DNA of all patients showed in total 11 mutations on only one allele. Three mutations are known to have no affect in the processing of SI. Among the remaining eight mutations we found one deletion mutant and seven mutations causing an amino acid exchange (V577G, S694P, T694P, G1073D, C1229Y, R1367G, and F1745C). Further researches were made on these mutations. Except for the mutation R1367G all mutations had an effect on the transport and folding of the SI. In six of the 11 patients the phenotype of CSID could be explained by compound heterozygosity because of two identified mutations, respectively. The other patients showed only one mutation, suggesting that symptoms of the CSID can also be found among heterozygote persons. In how far other components play a role in this process remains to be elucidated.   The change of a cysteine to a serine by site-directed mutagenesis was performed in the LPHα subunit to alter the position of a disulfide bond. Thereby the effect of a malfolded intramolecular chaperon on the mature protein should be analyzed. The mutation caused a slowed protein with a reduced enzymatic activity. The decelerated transport might be caused by a slowed folding of the LPHα, the reasons of the reduced activity could be a malfolding in the active center. 

Die Erforschung und das Verständnis des intrazellulären Proteintransportes konnten bereits in der Vergangenheit zur Entwicklung verschiedener Pharmazeutika beitragen. Patienten mit Erkrankungen aufgrund eines Proteindefektes konnte so eine verbesserte Lebensqualität ermöglicht werden. Entscheidend waren dabei die Erkenntnisse, die aus natürlich vorkommenden Mutationen eines Proteins gefolgert werden konnten. Durch die Beobachtung einer veränderten Faltung und einer damit einhergehenden Proteinaktivität konnten Mechanismen erkannt werden, die das Sortierverhalten eines Proteins innerhalb einer Zelle beeinflussen. Da aber noch immer eine Vielzahl von Fragen nicht geklärt werden konnte, ist es unbedingt erforderlich, diese Forschungsrichtung weiter voranzutreiben. Dazu wurden in der vorgelegten Arbeit sowohl natürlich vorkommende Mutationen der Saccharase-Isomaltase (SI) als auch eine künstlich generierte Mutation der Laktase-Phlorizin-Hydrolase biochemisch und zellbiologisch untersucht. Zur Identifizierung von Mutanten der SI wurden von elf Patienten mit Symptomen der congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID) Blut- bzw. Darmbiopsieproben gewonnen. Aus der Biopsieprobe eines Patienten konnte mittels RT-PCR die cDNA gewonnen werden, aus den Blutproben aller Patienten wurde die genomische DNA isoliert. Aus diesen wiederum wurde mittels PCR die für die SI codierende Sequenz amplifiziert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Dabei konnten in der cDNA des einen Patienten zwei signifikante Mutationen in Form eines Aminosäureaustausches nachgewiesen werden. Die erste Mutation führte zu einem Austausch von Asparaginsäure zu Asparagin an Position 366 der Aminosäuresequenz, wurde aber im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht, da ein ähnlicher Polymorphismus  (Q1203E) bereits beschrieben wurde und eine in silico Untersuchung keine Änderung der Proteinstruktur ergab. Die zweite Mutation war in der Isomaltase-Untereinheit lokalisiert und führte zu einem Austausch der Aminosäure Cystein zu Argenin (C635R). Diese Mutation wurde mittels Mutagenese-PCR in die Wildtypsequenz der SI eingebaut und führte in vitro zu dem Bild einer schwach glykosylierten, langsam transportierten und nach apikal und basolateral sortierten Form des Proteins, die überwiegend im endoplasmatischen Retikulum (ER) akkumulierte. Aufgrund dieses Erscheinungsbildes konnte für die CSID ein siebter Phänotyp beschrieben werden, der sich z. T mit dem Phänotyp 2 und 4 überschneidet. Zudem zeigte diese Mutation, dass Proteine, die in polaren Zellen sowohl nach apikal als auch nach basolateral transportiert werden, bereits im ER über die Assoziierung mit Tween20-resistenten DRMs sortiert werden. In der genomischen DNA der Patienten konnten insgesamt 11 heterozygote Mutationen identifiziert werden, von denen drei bereits bekannt waren und keinen Effekt auf die Prozessierung der SI hatten. Unter den übrigen acht Änderungen befanden sich eine Deletionsmutante und sieben Mutationen, die sich in Form eines Aminosäureaustausches darstellten (V577G, S694P, T694P, G1073D, C1229Y, R1367G, F1745C) und weiter untersucht wurden. Abgesehen von der Mutante R1367G beeinflussten alle Mutationen die Transport- und Faltungseigenschaften der SI. Da bei sechs der elf Patienten zwei verschiedene Mutationen identifiziert werden konnten, kann man bei den betroffenen Personen von einer kombinierten Heterozygotie ausgehen. Die übrigen Patienten wiesen nur eine Mutation auf, so dass angenommen werden kann, dass auch heterozygote Merkmalsträger Symptome der CSID aufweisen können. Inwiefern andere Komponenten dabei eine Rolle spielen, bedarf der weiteren Aufklärung.   Durch den Austausch eines Cysteinrestes gegen ein Serinrest mit Hilfe der oligonukleotidgerichteten PCR  wurde eine Disulfidbrücke innerhalb des LPHα-Profragmentes verändert, um den Einfluss eines mangelhaft gefalteten intramolekularen Chaperons auf das reife Polypeptid zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass diese Mutation ein verlangsamtes und in seiner Aktivität herabgesetztes reifes Polypeptid generiert. Die Transportverzögerung könnte durch einen verlangsamten Faltungsprozess der α-Untereinheit bedingt sein, die Aktivitätsänderung durch ein mangelhaft gefaltetes aktives Zentrum.

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Keiser, Markus Wolfdiedrich Bernard: Transportverhalten natürlich vorkommender und künstlich generierter Mutationen intestinaler Enzyme in polaren und unpolaren eukaryotischen Zellen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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