Transportverhalten natürlich vorkommender und künstlich generierter Mutationen intestinaler Enzyme in polaren und unpolaren eukaryotischen Zellen

Die Erforschung und das Verständnis des intrazellulären Proteintransportes konnten bereits in der Vergangenheit zur Entwicklung verschiedener Pharmazeutika beitragen. Patienten mit Erkrankungen aufgrund eines Proteindefektes konnte so eine verbesserte Lebensqualität ermöglicht werden. Entscheidend waren dabei die Erkenntnisse, die aus natürlich vorkommenden Mutationen eines Proteins gefolgert werden konnten. Durch die Beobachtung einer veränderten Faltung und einer damit einhergehenden Proteinaktivität konnten Mechanismen erkannt werden, die das Sortierverhalten eines Proteins innerhalb einer Zelle beeinflussen. Da aber noch immer eine Vielzahl von Fragen nicht geklärt werden konnte, ist es unbedingt erforderlich, diese Forschungsrichtung weiter voranzutreiben. Dazu wurden in der vorgelegten Arbeit sowohl natürlich vorkommende Mutationen der Saccharase-Isomaltase (SI) als auch eine künstlich generierte Mutation der Laktase-Phlorizin-Hydrolase biochemisch und zellbiologisch untersucht. Zur Identifizierung von Mutanten der SI wurden von elf Patienten mit Symptomen der congenitalen Saccharase-Isomaltase Defizienz (CSID) Blut- bzw. Darmbiopsieproben gewonnen. Aus der Biopsieprobe eines Patienten konnte mittels RT-PCR die cDNA gewonnen werden, aus den Blutproben aller Patienten wurde die genomische DNA isoliert. Aus diesen wiederum wurde mittels PCR die für die SI codierende Sequenz amplifiziert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Dabei konnten in der cDNA des einen Patienten zwei signifikante Mutationen in Form eines Aminosäureaustausches nachgewiesen werden. Die erste Mutation führte zu einem Austausch von Asparaginsäure zu Asparagin an Position 366 der Aminosäuresequenz, wurde aber im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht, da ein ähnlicher Polymorphismus  (Q1203E) bereits beschrieben wurde und eine in silico Untersuchung keine Änderung der Proteinstruktur ergab. Die zweite Mutation war in der Isomaltase-Untereinheit lokalisiert und führte zu einem Austausch der Aminosäure Cystein zu Argenin (C635R). Diese Mutation wurde mittels Mutagenese-PCR in die Wildtypsequenz der SI eingebaut und führte in vitro zu dem Bild einer schwach glykosylierten, langsam transportierten und nach apikal und basolateral sortierten Form des Proteins, die überwiegend im endoplasmatischen Retikulum (ER) akkumulierte. Aufgrund dieses Erscheinungsbildes konnte für die CSID ein siebter Phänotyp beschrieben werden, der sich z. T mit dem Phänotyp 2 und 4 überschneidet. Zudem zeigte diese Mutation, dass Proteine, die in polaren Zellen sowohl nach apikal als auch nach basolateral transportiert werden, bereits im ER über die Assoziierung mit Tween20-resistenten DRMs sortiert werden. In der genomischen DNA der Patienten konnten insgesamt 11 heterozygote Mutationen identifiziert werden, von denen drei bereits bekannt waren und keinen Effekt auf die Prozessierung der SI hatten. Unter den übrigen acht Änderungen befanden sich eine Deletionsmutante und sieben Mutationen, die sich in Form eines Aminosäureaustausches darstellten (V577G, S694P, T694P, G1073D, C1229Y, R1367G, F1745C) und weiter untersucht wurden. Abgesehen von der Mutante R1367G beeinflussten alle Mutationen die Transport- und Faltungseigenschaften der SI. Da bei sechs der elf Patienten zwei verschiedene Mutationen identifiziert werden konnten, kann man bei den betroffenen Personen von einer kombinierten Heterozygotie ausgehen. Die übrigen Patienten wiesen nur eine Mutation auf, so dass angenommen werden kann, dass auch heterozygote Merkmalsträger Symptome der CSID aufweisen können. Inwiefern andere Komponenten dabei eine Rolle spielen, bedarf der weiteren Aufklärung.   Durch den Austausch eines Cysteinrestes gegen ein Serinrest mit Hilfe der oligonukleotidgerichteten PCR  wurde eine Disulfidbrücke innerhalb des LPHα-Profragmentes verändert, um den Einfluss eines mangelhaft gefalteten intramolekularen Chaperons auf das reife Polypeptid zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass diese Mutation ein verlangsamtes und in seiner Aktivität herabgesetztes reifes Polypeptid generiert. Die Transportverzögerung könnte durch einen verlangsamten Faltungsprozess der α-Untereinheit bedingt sein, die Aktivitätsänderung durch ein mangelhaft gefaltetes aktives Zentrum.