Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Validierung ausgewählter koproskopischer Untersuchungsmethoden zum direkten Nachweis parasitärer Stadien verschiedener Parasitenspezies der Haussäugetiere

Kraemer, Amelie

Increasing demand on quality assurance and management systems in parasitological laboratories makes new and standardised validation of the methods used in those laboratories necessary. The goal of this project is to yield relevant data to contribute toward the validation of coproscopic methods used in veterinary-parasitological diagnostics for detecting parasitic stages according to their sensitivity, efficiency and variability. The validation of the combined Sedimentation-Flotation-method using zinc sulfate as flotation medium and the modified McMaster-method was performed by using eggs of A. caninum, U. stenocephala, C. oncophora, Cyathostominae, A. suum, T. leonina, T. canis, T. cati, T. vulpis, M. expansa and A. perfoliata. For the validation of the sedimentation method and the Baermann larval migration method eggs and larvae respectively of F. hepatica and D. viviparus were used as those methods are the special analytical procedures for them. With an egg count of 80 epg feces all parasites could be reproducibly detected, using the combined sedimentation-flotation method. The method sensitivity lacks measurably in variances when performed with lower numbers of eggs. The method efficiency improves with increasing egg numbers. The efficiency showed significant deviation at all concentration levels, e.g. at 80 epg, 1.5 % of eggs were retrieved. Since this method is used primarily for qualitative and semi-quantitative detection this comparatively low efficiency is of less importance. Using the McMaster-method no false-negative samples were detected, in egg counts of 500 epg. The variance in sensitivity of the method decreases with increasing egg count per gram feces. The method efficiency resulted in a mean of 49 % and showed relatively large variances. It can be assumed from the literature, that the method efficiency can be markedly improved with larger egg counts, such as 1000 epg, leading to a decrease in variance. Differences among parasites as well as parasitic groups led to results that were in hard to interpret. Various complicating factors could have contributed to this situation, such as variations in the characteristics of the eggs – surface conditions (e.g. electrostatic charge), density, maturity, interaction with flotation media – as well as the small sample sizes of some subpopulations. Differences in the sensitivity of the different methods exist between species at lower dilution levels near the detection limit. All parasites showed a 100 % sensitivity at certain concentrations of epgs used in this investigation. Employing the sedimentation method, eggs of F. hepatica, starting at 20 epg, could be reproducibly found. The efficiency was highly variable, and the maximum re-collection rate increased to 19,7 %. According to the Baermann migration method detecting D. viviparous, a 100 % detection rate was observed beginning with 6,3 larvae per gram feces in a thoroughly mixed-feces sample. The examination of unmixed fecal samples resulted in lower sensitivity, though sample sizes have been too low for statistically proven statements (n=120). The highest larval count was found in the unmixed fecal sample but showed large variation and (partly high inhomogeneous) readings, suggesting an uneven distribution of larvae in the sample. The results show that the combined sedimentation-flotation method is the method of choice for the qualitative diagnosis of the parasites investigated and also should be used as a quantified modification for low concentration egg counts in epidemiological studies. Whether or not this method can be improved and what properties other parasites may show is substance for further study. The McMaster-method shows little validity for egg counts below 1000 epg due to the method´s low efficiency for a reliably quantitative determination in this range. A number of authors have made suggestions for improving and standardizing the efficiency of the McMaster-method. Both, sedimentation and Baermann migration are methods of choice with sufficient sensitivity in qualitative diagnostics for the detection of trematode stages and nematode larvae, respectively.

Mit zunehmenden Anforderungen an parasitologische Labors durch Qualitätssicherungs- und -managementsysteme ist die Validierung der dort verwendeten Methoden unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es, mit der Gewinnung relevanter Daten einen Beitrag zur Validierung der in der veterinärparasitologischen Diagnostik gebräuchlichen koproskopischen Methoden unter den hier beschriebenen Bedingungen zum Nachweis parasitärer Stadien hinsichtlich ihrer Sensitivität, Effektivität und des Variationskoeffizienten zu leisten. Die Validierung wurde für die kombinierte Sedimentations-Flotations – und die McMaster-Methode anhand von Eiern von Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Cooperia oncophora, Anoplocephala perfoliata, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Toxocara canis, Toxocara cati, Trichuris vulpis, Moniezia expansa und verschiedener Cyathostominae durchgeführt. Die Sedimentation und das Auswanderverfahren nach Baermann wurden als spezielle Nachweisverfahren für Fasciola hepatica bzw. Dictyocaulus viviparus mit Eiern bzw. Larven dieser Parasiten validiert. Mit der hier beschriebenen kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode unter der Verwendung von ZnSO4-Lösung konnten die hier untersuchten Parasiten ab einer Eizahl von 80 Eiern pro Gramm Kot sicher (Sensitivität 100 %) detektiert werden. In niedrigeren Eizahlen unterliegt die Sensitivität der Methode zum Teil großen Schwankungen. Die Effektivität der Methode stieg mit zunehmender Eizahl. Bei 80 Eiern pro Gramm Kot wurden 1,5 % der Eier wiedergefunden, die Effektivität unterlag in allen Konzentrationsstufen starken Schwankungen. Da diese Methode aber vorrangig zur qualitativen und semiquantitativen Diagnostik angewandt wird, ist diese vergleichsweise geringe Effektivität von untergeordneter Bedeutung. Mit der McMaster-Methode konnten von den hier untersuchten Parasiten ab einer Eizahl von 500 Eiern pro Gramm Kot keine falsch negativen Proben mehr gefunden werden. Die Varianz in der Sensitivität der Methode nahm mit zunehmender Eizahl pro Gramm Kot ab. Die Effektivität der Methode betrug im Mittel 49 % und unterlag relativ hohen Schwankungen. Die Untersuchung der Unterschiede sowohl zwischen den Parasiten als auch zwischen den Parasitenordnungen ergab zum Teil sehr schwer zu interpretierende Ergebnisse, so dass davon ausgegangen werden kann, dass verschiedene Einflussfaktoren wie unterschiedliche Oberflächenbeschaffenheit, Dichte, Reifezustände, elektrostatische Oberfläche der Eier und unterschiedliche Interaktion des Flotationsmediums mit den Eiern sowie die für statistische Auswertungen immer noch geringe Probenzahl eine größere Rolle spielen als bisher angenommen. Es konnte jedoch für die Sensitivität der untersuchten Methoden gezeigt werden, dass sich die Parasiten nur im unteren Grenzbereich der Sensitivität unterscheiden. Ab einer bestimmten Eizahl pro Gramm Kot ist die Sensitivität für alle Parasiten immer 100 %. Mit der einfachen Sedimentationsmethode nach Benedek konnten Eier von F. hepatica ab 20 Epg sicher nachgewiesen werden. Die Effektivität unterlag starken Schwankungen, die maximale Wiederfindungsrate betrug 20 %. Mit dem Auswanderverfahren nach Baermann wurde für D. viviparus ab einer Larvenzahl von 6,3 pro Gramm Kot aus einer vorher gründlich vermengten Kotprobe eine 100 %ige Sensitivität ermittelt. Der höchste Prozentsatz an Larven wurde in der ungerührten Kotprobe gefunden, er unterlag aber großen Schwankungen und war zum Teil falsch überhöht, was auf die ungleichmäßige Verteilung der Larven in der Probe schließen lässt. Die Ergebnisse zeigen, dass von den hier untersuchten Methoden die beschriebene kombinierte Sedimentations-Flotationsmethode für die qualitative Diagnostik der hier untersuchten Parasiten die Methode der Wahl ist und für die Untersuchung niedriger Eizahlen in epidemiologischen Studien quantifiziert werden sollte. Ob die Methode weiter verbessert werden kann und wie sich andere als die hier untersuchten Parasiten in der Methode verhalten, sollte in weiteren Untersuchungen ermittelt werden. Zur Bestimmung der in einer Probe enthaltenen Eizahl pro Gramm Kot eignet sich die McMaster-Methode nicht für Eizahlbereiche bis 1000 EpG, da hier die Effektivität der Methode für eine zuverlässige quantitative Bestimmung. nicht ausreichend ist. Ab welcher Eizahl pro Gramm Kot sich die Ergebnisse den realen Werten annähern, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Zur Verbesserung und Standardisierung der Effektivität der McMaster-Methode wurden von verschiedenen Autoren Vorschläge gemacht. Sowohl die Sedimentationsmethode als auch das Auswanderverfahren nach Baermann sind wie hier beschrieben für die mit diesen Methoden untersuchten Parasiten von guter Sensitivität und daher Methoden der Wahl zur qualitativen Diagnostik.

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Kraemer, Amelie: Validierung ausgewählter koproskopischer Untersuchungsmethoden zum direkten Nachweis parasitärer Stadien verschiedener Parasitenspezies der Haussäugetiere. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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