Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Pharmakologische Beeinflussung muriner dendritischer Zellen durch nichtsteroidale und steroidale Antiphlogistika

Krekeler, Stefanie Claudia

The present study was performed to evaluate the influence of nonsteroidal (NSAIDs) and steroidal anti inflammatory drugs on dendritic cells in vitro and in vivo by using a contact hypersensitivity model. During in vivo test, particular focus was put on whether the test substances may inhibit the allergic reaction in the sensitization phase as well as in the challenge phase thereby decreasing the manifestation of contact dermatitis. As NSAID acetylsalicylic acid (ASA), indomethacin and tepoxalin were used. Diflorasone diacetate was used as steroidal anti inflammatory drug. The in vitro effect of the test substances was examined on the TNF-a and PGE2 release of LPS stimulated DC. TNF-a as well as PGE2play an important role on DC maturation and migration. First, murine dendritic cells were cultivated from bone marrow, then incubated with the test substances and finally the cytokine- and prostaglandin concentration was measured by ELISA. The LPS induced production of PGE2 was significantly reduced by all test substances, whereas indomethacin had no effect on TNF-a synthesis. Tepoxalin (10 mmol/l) had only a moderate effect on TNF-a-synthesis. Only ASA (2.5 and 5 mmol/l) and diflorasone diacetate caused significant inhibition. The in vivo tests were performed in the sensitization phase and challenge phase in a murine TDI induced contact allergy model. During sensitization phase, the drug dependent effect on DC migration (Skin-DC-Migration-Assay), DC-T-cell interaction by the number of lymph nodes cells and their weight as well as the lymph nodes’ CD11c+-cell population (LLNA) and MMP-9 expression were evaluated. During the challenge phase additional parameters such as ear swelling (MEST), migrated skin DC (CD11c+- and CD40+-cells) of the lymph nodes and MHC-II+-cells in the epidermis were used. PGE2-concentration was measured in the ear tissue of mice treated with ASA, indomethacin and diflorasone diacetate. As only moderate effects of topical applied ASA during sensitization phase and challenge phase was observed, in analogy to the in vivo experiment, transdermal resorption of ASA through the abdominal skin of mice was evaluated using the Franz diffusion cell. The results of the in vivo experiments as well as the results of the Franz diffusion cell test suggest that sufficient tissue level for inhibiting COX and NF-KB activities is achieved only in superficial areas of the skin after topical application of ASA. The results of the in vivo experiments demonstrate that inflammation response in contact allergy can not be suppressed only by inhibition of DC migration. There must be other factors involved in providing immune responses. The TDI induced contact-allergy is not impaired by systemic application of ASA. Nevertheless, all other parameters are inhibited compared to the control group. ASA has a direct effect on DC function, whereas, indomethacin seems to have a different mechanism of action. Indomethacin inhibits the T-cell mediated immune response as well the T-cell proliferation but it does neither inhibit migration of dermal DC into the draining lymph node nor does it inhibit MMP-9 activity in vivo. Ex vivo inhibition of the migration (Skin-DC-Migration-Assay), as well as inhibition of LC-migration was proven. Contact allergy and function of DC is only inhibited noticeably by diflorasone diacetate. Treatment with Tepoxalin has no effect on the allergic inflammatory reaction, independent of administration route. During the period of sensitization only diflorasone diacetate did influence migration and DC-T-cell interaction.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss nichtsteroidaler und steroidaler Antiphlogistika auf dendritische Zellen in vitro und in vivo untersucht. Bei den In-vivo-Untersuchungen war von besonderem Interesse, ob die eingesetzten Testsubstanzen die allergische Immunreaktion sowohl in der Sensibilisierungs,- als auch in der Challenge-Phase hemmen können und somit die Manifestation der Kontaktallergie unterdrückt wird. Als nichtsteroidale Antiphlogistika wurden ASS, Indometacin und Tepoxalin eingesetzt, als steroidales Antiphlogistikum wurde Diflorasondiacetat verwendet. In vitro wurde die Wirkung der Pharmaka auf die LPS-stimulierte TNF-a- und PGE2-Synthese untersucht. Sowohl TNF-a als auch PGE2 spielen eine wichtige Rolle bei der Maturation und Migration der DC. Dazu wurden aus murinem Knochenmark DC gewonnen, mit den Testsubstanzen inkubiert und die Zytokin bzw. Prostaglandinkonzentration mittels ELISA gemessen. Die LPS-induzierte PGE2-Synthese wurde von allen eingesetzten Substanzen signifikant gehemmt. Auf die TNF-a-Synthese dagegen hatte Indometacin keinen und Tepoxalin (10 µmol/l) nur eine moderaten Effekt. Eine signifikante Inhibition wurde nur durch ASS (2,5 und 5 mmol/l) und Diflorasondiacetat erreicht. Die In-vivo-Untersuchungen wurden in einem murinen TDI-Kontaktallergiemodell in der Sensibilisierung und in der Challenge durchgeführt. In der Sensibilisierung wurde die Wirkung der Substanzen auf die Migration der DC (Skin-DC-Migration-Assay), auf die DC-T-Zellinteraktion anhand des Lymphknotengewichtes und der Gesamtzellzahl des Lymphknotens, auf die CD11c+-Zellpopulation in den Lymphknoten (LLNA), sowie auf die Expression der MMP-9 untersucht. In der Challengephase wurden als zusätzliche Parameter die Ohrschwellung (MEST), die Bestimmung der in den Lymphknoten migrierten epidermalen und dermalen DC (CD11c+- und CD40+-Zellen) und die Bestimmung der MHC-II+-Zellen in der Epidermis verwendet. Außerdem wurde in den Gewebehomogenaten der mit ASS, Indometacin und Diflorasondiacetat behandelten Tiere die PGE2-Konzentration gemessen. Aufgrund der moderaten Effekte nach topischer Applikaton von ASS, wurde in Analogie zu dem In-vivo-Versuch, die transdermale Resorption von ASS durch die Bauchhaut von Mäusen bestimmt. Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche als auch die Ergebnisse der Versuche zur transdermalen Resorption lassen vermuten, dass ausreichende Gewebespiegel von ASS nach topischer Applikation, für eine Hemmung der COX oder sogar von NF-kB, nur in oberflächlich gelegenen Gewebearealen erreicht werden. Die Ergebnisse der In-vivo-Untersuchungen verdeutlichen, dass die Inhibition der DC-Migration allein nicht ausreicht, um das klinische Bild der Kontaktallergie zu unterdrücken. Es müssen noch andere Faktoren bei der Vermittlung der Immunantwort eine Rolle spielen. Im TDI-Kontaktallergiemodell wurde die Induktion der Kontaktallergie durch ASS (systemisch) nicht unterdrückt, obwohl alle anderen Untersuchungsparameter durch die systemische Applikation von ASS signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe gehemmt wurden. Während ASS direkt die DC-Funktion beeinflusst, ist für Indometacin offensichtlich ein anderer Effektormechanismus anzunehmen. Indometacin hemmt zwar die T-Zell-vermittelte Immunantwort sowie die T-Zellproliferation, nicht aber in vivo die Migration der dermalen DC in den drainierenden Lymphknoten sowie die MMP-9-Aktivität. Nur ex vivo konnte eine Migrationsinhibition (Skin-DC-Migration-Assay) beobachtet werden, sowie eine Hemmung der LC-Migration. Sowohl die Kontaktallergie als auch die Funktion der DC wird nur durch Diflorasondiacetat wirkungsvoll inhibiert. Die Behandlung mit Tepoxalin hat, unabhängig von der Verabreichung, keine Wirkung auf die allergische Entzündungsreaktion. In der Sensibilisierungsphase hatte nur Diflorasondiacetat Einfluss auf die Migration der DC sowie die DC-T-Zell-Interaktion.

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Krekeler, Stefanie Claudia: Pharmakologische Beeinflussung muriner dendritischer Zellen durch nichtsteroidale und steroidale Antiphlogistika. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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