Biochemical and structural alteration of the porcine zona pellucida (ZP) during maturation (in vivo and in vitro) and fertilization (IVF)

Moreira, A. C.

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Biochemical and structural alteration of the porcine zona pellucida (ZP) during maturation (in vivo and in vitro) and fertilization (IVF)

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Die Zona pellucida (ZP) der Oozyten spielt bei der Befruchtung eine zentrale Rolle. Matrixoberfläche und dreidimensionale Architektur der ZP unterliegen dabei einer Reihe von Reifungs-und Transformationsprozessen. Hier steht insbesondere das sog. Zona hardening im Vordergrund, das für den Polyspermieblock essentiell ist. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, die Zona pellucida (ZP) während der Reifung und der In vitro Befruchtung (IVF) von porcine Oozyten näher zu charakterisieren, mit besonderem Blick auf die biochemischen und strukturellen Veränderungen der Zona pellucida (ZP). Dabei sollte insbesondere die Bildung und die Verteilung von den Disulfidbrücken analysiert und deren Rolle für die Etablierung der Polyspermieblock untersucht werden. Für das Erreichen dieser Zielsetzung wurde dieses Projekt in sieben Abschnitte gegliedert, wobei in jeder eine (1) der folgenden Gruppen untersucht wurde: (i) Experiment I: Immature Oozyten (germinal vesicle), (ii) Experiment II: In Vitro gereiften (IVM) Oozyten von 23 Stunden (MI), (iii) Experiment III: In vitro gereiften (IVM) Oozyten von 46-48 Stunden (MII), (iv) Experiment IV: In vivo gereiften Oozyten von präpuberalen Saureren (MII), (v) Experiment V: In vitro gereiften (IVM) Oozyten (46-48 Stunden, MII) nach 0, 3, und 18 Stunden In vitro Befruchtung (IVF), (vi) Experiment VI: In vivo gereiften Oozyten (MII) nach 0, und 3 Stunden In vitro Befruchtung (IVF), (vii) Experiment VII: In vitro und In vivo gereiften Oozyten nach 18 Stunden In vitro Spermienfreien FertTalp Medium. In der vorliegenden biochemischen Untersuchung („Pretrial I“) wurden die drei Glycoproteine der pZP mittels eindimensionaler (1–D SDS–PAGE) und zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese (2–D SDS–PAGE) aufgetrennt. Es folgte eine Charakterisierung der freien Thiolgruppen der Cysteine innerhalb der Glykoproteine der ZP (ZPA, ZPB, und ZPC) von ungereiften porcine Oozyten (GV). Die ZP wurde mit BIAM (biotin- conjugated iodoacetamide) unter mehreren pH-Bedingungen (pH 8,5 und pH 6,5) umgesetzt (KIM et al. 2000), über SDS–PAGE (1–D SDS–PAGE und 2–D SDS–PAGE) separiert und die biotinilierten Cystein Aminosäuren selektiv nachgewiesen. In der vorliegenden Strukturanalyse („Trial II“ und „Trial III“) wurde die ZP durch konfokale Mikroskopie (LSCM, „Trial II“) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM, „Trial III“) morphologisch untersucht. Für LSCM wurden die ZP Glykoproteine mit 5-Iodoacetamidefluorescein (5-IAF) unter pH 6,5 behandelt. Es wurde eine multikomparative und semi-quantitative Analyse von dem Muster der Fluoreszenzintensität (I), der Fluoreszenzhomogenität (H) und Muster der Differenz (D) der Fluoreszenzintensitäten der inneren (I) und äußeren (A) Oberfläche der ZP durchgeführt. Für die SEM wurden die ZP Glykoproteine mit BIAM unter pH 6,5 behandelt und mittels Streptavidin- Goldenpartikel die Verteilung der Thiolgruppen innerhalb der äußeren Oberfläche der ZP nachgewiesen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: 1. In der 1–D SDS–PAGE zeigte die Reaktion des ZP Glykoproteins mit BIAM unter pH–Wert von 8,5 die Oxidation aller virtually freien Thiolgruppen Glycoproteins ZPA, ZPB und ZPC. Im Gegensatz dazu konnte unter pH-Bedingung von 6,5 eine selektive Markierung von ZPA beobachtet werden. 2. In der 2–D SDS–PAGE zeigte ZPA Glykoprotein eine dominante Markierung im pI-Bereich 4–6 mit BIAM unter pH–Wert von 8,5, ZPB/ZPC Glykoproteins eine starke Markierung in einer breiten Markierung von pI-Bereich 3–6,5. Die Reaktion mit BIAM unter pH 6,5 führte zur selektiven Markierung der ZPA Glycoprotein. ZPA erschien als ein Single-Protein-Band. 3. Im Experiment I (LSCM) zeigte die Analyse von ungereiften ZP (GV) zwei dominante Populationen von Fluoreszenzhomogenitätmustern (H): (a) niedrige (H = 1, 47,8%), and (b) keine Homogenität (H = 0, 26,1%). 4. 51,1% von der ZP (LSCM) von Metaphase I Eizellen (MI, 23 Stunden IVM) besitzen mittlere (H = 2) Fluoreszenzhomogenitätmuster (H). Statistische signifikante Differenzen zwischen GV und MI wurden gefunden (P < 0,007). 5. Im Experiment III 57,9% von der ZP von In vitro gereiften (IVM) Metaphase II Eizellen (46–48 Stunden, IVM) führen zu einer erhöhten Fluoreszenzhomogenität (H = 3). Statistische signifikante Differenzen zwischen MI und MII wurden gefunden (P < 0,0001). 6. Experiment IV: In vivo Reifung von Oozyten führt zur Etablierung einer niedrigen (H = 1, 23,6%) bis mittleren (H = 2, 53,6%) Fluoreszenzhomogenität. Währendessen zeichnen sich 57,9% der ZP von In vitro gereiften (IVM) Oozyten durch das Fluoreszenzhomogenitätmuster H = 3 aus. Signifikante Unterschiede zwischen In vivo und In vitro gereiften (IVM) Oozyten wurden gefunden (P < 0,0001). 7. Experiment V: 95,5% von der ZP von IVM Eizellen nach 0 Stunden des IVF Prozesses führen zu einem hohen Fluoreszenzintensitätenmuster (I = 3) und 70,6% von der ZP von IVM Eizellen nach 3 Stunden des IVF Prozesses besitzen ein Fluoreszenzintensitätenmuster (I = 3). Im gegensatz dazu zeigen 60,0% die ZP von IVM nach 18 Stunden des IVF Prozesses keine Fluoreszenzintensitätenmuster (I = 0). Signifikante Unterschiede zwischen 3 Stunden und 18 Stunden wurden gefunden (P < 0,0001). 8. Experiment VI: 67,6% von der ZP von In vivo gereiften Oozyten nach 3 Stunden des IVF Prozesses zeigen keine Fluoreszenzintensitätenmuster (I = 0). Signifikante Unterschiede zwischen In vivo und In vitro gereiften Oozyten nach 3 Stunden des IVF Prozesses wurden gefunden (P < 0,0001). 9. Experiment VII: In vivo und IVM Oozyten, die in einem spermienfreien FertTalp Medium für 18 Stunden inkubiert waren, zeigten ein hohes Fluoreszenzintensitätenmuster (I = 2; I = 3). Das lässt vermuten, dass sowohl In vivo als auch In vitro gereifte Oozyten nun nach der Penetration zur Bildung neuer Disulfidbrücken (i.e. Verbrauch von freien Thiolgruppen) befähigt sind. 10. SEM: Die Verteilung der Thiolgruppen innerhalb der äußeren Oberfläche der ZP zeigten signifikante Unterschiede zwischen ungereiften (GV) und In vitro gereiften (IVM) Eizellen (MII) (P < 0,0001). 11. Bei Benutzung von SEM auf dem IVF Prozess der Oozyten zeigten nach 18 Stunden (IVF) 70,7% keine (Null) Streptavidin Goldpartikel an der ZP Oberfläche. Signifikante Unterschiede mit dem Muster der ZP von MII wurden gefunden (P < 0,0001). 12. Basierend auf den vorgelegten Ergebnissen der Arbeitsgruppe ist zu sagen, dass der Verlust von Thiolgruppen während des Befruchtungsprozesses (IVF) eine mögliche Begründung für die Modifikation von ZP-Struktur sein könnte, welche als Barriere zur polyspermischen Eindringung dient. In In vitro gereiften (IVM) Oozyten wächst die strukturelle Alteration der ZP relativ spät (18 Stunden nach IVF) verglichen mit in In vivo gereiften Oozyten (3 Stunden nach IVF). Dies zeigt an, dass die verzögerte Bildung von neuen Disulfidbrücken (i.e. Verbrauch von freien Thiolgruppen) von In vitro gereiften (IVM) Oozyten, wenn sie verglichen werden mit In vivo gereiften Oozyten (nach 3 Stunden IVF), eine mögliche Erklärung für den hohen Anteil polyspermie Befruchtung nach IVM und IVF ist. Jedoch müssen zu dieser Thematik weitere Studien angefertigt werden. Es könnte weiterhin noch hinterfragt werden, welche Rolle nach unterschiedlichem Maturation-Prozess die Zona pellucida (ZP) während der In vivo und In vitro Reifung (IVM) für das Zona hardening durch die Bildung von Disulfidbrücken spielt.

All vertebrate oocytes are surrounded by an extracellular matrix. In mammals this matrix is known as the zona pellucida (ZP). One of its functions is to prevent polyspermy by - the so-called zona block - which is a biochemical and structural alteration of the ZP glycoproteins induced by release of cortical granule (CG) contents. The goal of the study was to examine and compare the distribution of free cysteine thiol residues of the ZP glycoproteins. Seven different groups of oocytes were used for the investigation: (i) immature oocytes (germinal vesicle, Exp. I); (ii) oocytes matured in vitro (IVM) for 23 h (metaphase I, Exp. II); (iii) oocytes matured in vitro (IVM) for 46- to 48 h (metaphase II, Exp. III); (iv) oocytes matured in vivo (metaphase II, Exp. IV); (v) oocytes derived from IVF of in vitro matured (IVM) oocytes, 0, 3, and 18 h after IVF (Exp. V); (vi) oocytes derived from IVF of in vivo matured oocytes 0, and 3 h after onset of IVF (Exp. VI); and (vii) oocytes derived from in vivo and in vitro maturation (IVM) cultured under IVF conditions, but without exposure to spermatozoa. The biochemical aim (Pre-Trial I) of this study was to analyze the distribution of the oxidant-sensitive cysteine (Cys) residues in the ZP glycoproteins ZPA, ZPB, and ZPC by electrophoretic methods. For this purpose different pH levels (pH 6.5 and 8.5) were used in order to optimize the labelling technique for the further morphologic evaluation by laser scanning confocal microscopy (LSCM) (Trial II) and scanning electron microscopy (SEM) (Trial III) of ZP from the different sources described above. For LSCM the ZP was treated with direct fluorescent labelled 5- Iodoacetamidefluoresceín (5-IAF at pH 6.5). For SEM the ZP was treated with biotin-conjugated iodoacetamide (BIAM) at below pH 6.5 and subsequently monitored with streptavidin gold particles. Multi-comparative and semi-quantitative statistical analysis was applied to the intensity fluorescence pattern (I), homogeneity pattern (H), and the difference (D) between inner (I) and outer (A) surface of the ZP of all stages. The following results were obtained: 1. One dimensional (1–D SDS–PAGE) BIAM (pH 8.5) revealed oxidation of virtually all free cysteine thiols of the glycoproteins ZPA, ZPB, and ZPC. In contrast, BIAM at pH 6.5 led to selective labelling within ZPA glycoprotein, while no labelling of glycoproteins ZPB and ZPC was present. 2. Two dimensional (2–D SDS–PAGE) BIAM (pH 8.5) revealed dominant labelling of the ZPA glycoprotein between pH 4– and 6, whereas there was strong labelling of ZPB and ZPC glycoproteins over a wide pH range from pH 3 to– 6.5. In contrast, BIAM at pH 6.5 led to selective labelling of the ZPA glycoproteins, while there was no staining of ZPB and ZPC glycoproteins. 3. The staining homogeneity of the ZP from the germinal vesicle (GV) stages was minor (H = 0, 26.1%) and low (H = 1, 47.8%). The staining homogeneity of the metaphase I (MI) oocytes was low (H = 1, 35.6%) to medium (H = 2, 51.1%), while that of metaphase II oocytes (MII) was medium (H = 2, 36.8%) to high (H = 3, 57.9%). After IVM (46–48 h, MII) there was a statistically significant shift to increased homogeneity (3) at P < 0.0001. 4. There were strong differences between the inner and outer region of the ZP from the germinal vesicle (GV) stages and metaphase I (23 h of IVM) (D = 2, 60.9% and 78.2%, respectively), while there were moderate (i.e. medium) differences between the inner and the outer regions of the ZP from MII (46–48 h of IVM) (D = 1, 68.5%). There was a statistically significant difference (D) pattern in the distribution of labelling in the ZP (P < 0.0001) between MI (23 h of IVM) and MII (46–48 h). 5. The homogeneity of oocytes matured in vivo (MII) was low (H = 1, 28.6%) and medium (H = 2, 53.6%), while that of IVM (MII) was medium (H = 2, 36.8%) to high (H = 3, 57.9%). There was a highly significant difference in the homogeneity of staining of the ZP (P < 0.0001) between in vivo and IVM (46–48 h) oocytes. 6. The staining intensity of oocytes matured in vivo (MII) was medium (I = 2, 37.9%) and strong (I = 3, 68.6%), while that of oocytes matured in vitro (IVM) was always strong (I = 3, 95.5%). There was a significant difference in the staining intensity distribution of the ZP (P < 0.0001) between IVM oocytes and those matured in vivo. 7. There was a strong fluorescence distributed across the ZP 0 and 3 h after IVF (I = 3, 95.5%, and I = 3, 70.6%, respectively). On the other hand, the fluorescence intensity of IVM oocytes was zero 18 h after onset of IVF (I = 0, 60.0%). There was a highly signicant difference in fluorescence intensity (I) classified as (1), (2), (3) of fertilized ZP 3 and 18 h after onset of IVF at P < 0.0001. 8. No fluorescence labelling occurred in oocytes matured in vivo 3 h after onset of IVF (I = 0, 67.6%), while there was strong fluorescent staining in 70.6% of the oocytes matured in vitro (IVM) (3 h after IVF) (I = 3). There was a significant difference (P < 0.0001) in intensity of fluorescence staining between fertilized ZP (3 h after onset of IVF) derived from in vivo and of IVM oocytes. 9. After incubation in FertTalp medium for 18 h without exposure to spermatozoa, both in vivo and in vitro matured (IVM) oocytes exhibited high fluorescence (I = 3, and I = 2, respectively), which suggests that both in vivo and in vitro matured (IVM) oocytes develop the ability to formation disulfide bonds only after penetration of spermatozoa. 10. SEM examination revealed that there was strong labelling with gold particles in the outer surface of the ZP (F = 3) from immature (GV) and IVM (MII) oocytes. These patterns apparently did not change substantially until 3 h after IVF, but 18 h after IVF there were no gold particles on the ZP surface (F = 0, 70.7%), and this is highly significant at P < 0.0001. In conclusion, the present results indicate that loss of free thiol groups during fertilization (IVF) could be the results of the formation of new intramolecular disulfide bonds of the ZPA glycoprotein, which may be crucial to the tertiary structure of the ZP, which prevents further sperm penetration. In porcine IVM, the alterations (e.g. biochemical and structural) of the ZP occurs relatively late (18 h after IVF) compared with oocytes matured in vivo (3 h after IVF). This may be a reason for the high polyspermic penetration in in vitro matured (IVM) oocytes derived from IVF. Further, it is possible that the formation of disulfide bonds triggered by ZP glycoproteins following fertilization and the global conformational changes of the three–dimensional structure of the ZP induce the hardening of the zona pellucida. However, further studies are clearly needed before the significance of this correlation can be fully assessed.