Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Messenger RNA-Expressionsprofile histon-assoziierter Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen und Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray

Nowak-Imialek, Monika Anna

The science of epigenetics deals with modulation of gene expression which does not involve changes of the sequence of base pairs. Although it is generally known that the many epigenetic modifications are based on DNA methylation and on covalent modifications of histones, there is very little published information about the control of bovine gene expression by histone modifications.   The first aim of the present study was to analyse the expression patterns of histone associated genes in bovine preimplantation embryos of different origins and thereby to detect aberrations which might be caused in early embryos produced by IVP and NT. Using semi-quantitative RT-PCR, it is possible to quantitatively analyse the expression of several genes in a single preimplantation embryo. Microarray technology makes it possible to efficiently analyse more complex expression profiles from such biological samples. In the second part of this study, the feasibility and reproducibility of cross-species array hybridisation was analysed.   Semi-quantitative endpoint RT-PCR was used for comparison of the relative amounts of genes involved in histone deacetylation [Histone deacetylase 2 (HDAC2)]; histone acetylation [Histone acetyltransferase 1 (HAT1)]; histone methylation [Histone methyltransferases (SUV39H1, G9A)]; heterochromatin formation [Heterochromatin protein 1 (HP1)]; and chromatin-mediated transcriptional regulation [Zygote arrest 1 (ZAR1)]; in oocytes, zygotes, 8-16-cells and blastocysts. The material analysed included embryos produced by in vitro fertilisation using two different culture systems (SOF and TCM), embryos collected in vivo, embryos produced by somatic cloning using adult male or female fibroblasts, embryos produced by parthenogenetic activation (two maternal genomes) embryos and androgenetic embryos containing two paternal genomes. Poly-(A)+RNA was isolated from pools of two embryos using a DYNABEADS mRNA DIRECT KIT. Poly-(A)+mRNA was reverse transcribed into cDNA using random hexamers and M-MLV reverse transcriptase. Specific gene expression was detected after cDNA amplification from 0.5 embryo equivalents for ZAR1 and HP1, 0.6 embryo equivalents for SUV39H1, 1.0 embryo equivalent for HDAC2, 0.4 embryo equivalents for HAT1 and 0.3 embryo equivalents for G9A. As an exogenously standard rabbit globin mRNA was added to each embryo. Assays were repeated five to ten times for each developmental stage after optimization of the amplification reaction for each pair of gene-specific primers. For most genes this linear range came between 31 and 34 cycles of amplification. A human cDNA microarray prepared at the Max Planck Institute for Molecular Genetics in Berlin was used for the analysis of bovine RNA by cross species hybridisation. The goal was to evaluate this protocol in a comparison of the RNA “transcriptome” of human and bovine foetal brains. The human microarray consisted of 349 fully sequenced human cDNAs (Human ENSEMBL set RZPD 1.1), each of which was spotted 20 times. Four replicates of the hybridisation were performed. The housekeeping gene HPRT and ß-actin were used as endogenous controls. Genes with different expression levels, which belonged to distinct families, were selected for semi-quantitative RT-PCR, which was used to verify the expression data generated by array. The genes selected were involved in cell cycle control and eukaryotic genome replication. RT-PCR was repeated at least three times for each gene.     The following results were obtained: 1.  For the genes MATER, NANOG, PEG3 and GCN5, despite many attempts, it was not possible to establish satisfactory amplification conditions. Therefore, PCR quantification of these genes was not performed. 2.      For the genes ZAR1, HDAC2, SUV39H1, G9A, HP1 and HAT1; it was possible to establish satisfactory PCR protocols and the mRNA expression levels of these genes were analysed in preimplantation bovine embryos of different origins. A.           ZAR1 mRNA levels gradually decreased during oocyte maturation and fertilization. The transcript was not detectable at the morula and blastocyst stage. This indicates that there is only maternal expression of this gene. B.           The amount of HDAC2 mRNA decreased in the zygote after artificial activation, fertilization and somatic cloning. At the blastocyst stage, there were differences in expression between androgenetic blastocysts and embryos after culture in SOF medium, parthenogenetic blastocysts, and cloned embryos produced from adult female fibroblasts. C.           The relative abundance of mRNA for HAT1 was significantly increased in immature oocytes compared with enucleated and activated-enucleated- oocytes. HAT1 transcripts were significantly increased in NT derived zygotes (from adult female fibroblasts) compared to in vitro fertilized zygotes (cultured in SOF medium), after artificial activation and parthenogenetic counterparts. No differences were found in the relative abundances of this gene at the 8-16-cell stage and blastocyst. D.           Histone methyltransferases (SUV39H1, G9A) and heterochromatin protein 1 (HP1) mRNA transcripts decreased in enucleated oocytes and after artificial activation compared with immature oocytes. The relative abundance of SUV39H1, G9A and HP1 transcripts were significantly increased in NT-derived zygotes (adult female fibroblasts) compared to artificially activated oocytes. SUV39H1 transcripts were significantly increased in the NT-zygotes derived from adult female fibroblasts compared to in vitro fertilized (SOF- and TCM-system) embryos and their parthenogenetic counterparts. No differences were found in the relative abundances of this gene at the 8-16-cell stage, except in the parthenogenetic embryos where the level of SUV39H1 transcripts was significantly higher than all other groups. At the blastocyst stage, the relative abundance of SUV39H1, G9A and HP1 transcripts were significant higher in NT-derived embryos from adult male fibroblasts than in their in vivo generated counterparts. E.            HP1 transcript levels were significant increased in NT-derived blastocysts (adult male fibroblast nuclear donors) compared to the parthenogenetic and NT-derived embryos produced from female fibroblasts. The increase in the relative abundance of HP1 transcripts was observed in in vitro fertilized (SOF- and TCM-system) blastocysts compared with in vivo generated blastocysts. At the blastocyst stage, a significant increase in SUV39H1 transcripts was seen in parthenogenetic and in vitro produced embryos (SOF-system) compared with their in-vivo generated counterparts. The G9A transcription level was significant increased in NT-derived blastocysts derived from male fibroblasts, as compared to NT-derived embryos produced from female fibroblasts.   3.      Using cross-species hybridisation (bovine RNA on a human cDNA-microarray), about 7000 data points could be used for statistic analysis. The overall correlation coefficient between orthologous genes on the cross species hybridisation was 0.94. A.           The coefficient of variation (CV) was calculated to test the variability in gene expression levels across four independent hybridisations. The results were divided into four classes of CVs. Class I include genes with CV<0.25 (highly reproducible signals). Genes with good reproducibility were defined as those with a CV between 0.25 and 0.5 and assigned to class II. Class III consisted of genes with a CV between 0.5 and 0.75 (medium reproducibility) and genes with a CV below 0.75 were considered to exhibit poor reproducibility (class IV). B.           Genes were grouped into three classes of expression levels with respect to the intensity of their signal above background (BG-tag): genes in class I (low, not detected) had a BG-tag value below 0.8, genes of class II (medium, possibly detected) had a BG-tag value between 0.8 and 0.9 and genes of class III (high expression, readily detectable) had a BG-tag value >0.9. Within class I, there were 19 bovine and 17 human genes. Class II, contained 26 bovine and 17 human genes, class III had 304 bovine and 315 human genes. C.           Screening of 349 known human genes against bovine ESTs made it possible to characterise some of the vast number of unknown genes in the bovine EST database. D.           Of the 349 genes analysed in this study, 16 genes had sequence homology greater than 95%; 137 genes had homology between 90% and 95%; 120 genes were 85% to 90% homologous; and 40 genes were 80% to 85% homologous. Only 3 genes had homology between 75% and 80% and 33 genes did not show any homology to published human sequences. E.            The endpoint RT-PCR study used a common set of gene-specific primers enabled co-amplification of both human and bovine transcripts. Microarray data showed moderate correlation with endpoint RT-PCR analysis.   Studies of histone associated genes demonstrated differences in gene expression between bovine embryos from different origins at different developmental time points. Significant differences in mRNA expression patterns between in vivo and in vitro or NT-derived embryos are crucial for improving systems for producing mammalian embryos in vitro and for minimizing the occurrence of developmental abnormalities. Analysis of the expression of histone associated genes provides insight into the function of these genes. These studies serve as a useful model for human assisted reproductive technology (ART), which is important because it has been observed in some cases that abnormal development has occurred after using ART. The application of cross-species hybridisation revealed only slight differences in the expression level and reproducibility of the signals in the two species. Cross-species gene expression comparisons will be a powerful tool in the future for the discovery of evolutionarily conserved mechanisms and pathways of expression control.

Die Epigenetik beinhaltet die Modulation der Genexpression, ohne dass die Nukleotidsequenz betroffen ist. Als Mechanismen, die dafür verantwortlich sind, werden hauptsächlich DNA-Methylierungen und Histonmodifikationen gesehen. Gene, die Histone modifizieren, spielen eine große Rolle bei der Aufklärung der epigenetischen Steuerung der Genexpression. Beim Rind gibt es wenig Informationen über die Genexpressionmuster histonmodifizierender Gene.   Ein Ziel dieser Arbeit war, das Expressionsmuster von Genen, die an den Histonmodifikationen beteiligt sind, in bovinen präimplantatorischen Embryonen unterschiedlicher Herkunft zu analysieren und dadurch Aufklärung über mögliche frühe Abberationen durch IVP und NT zu erhalten. Durch die RT-PCR ist es möglich, die Expression verschiedener Gene in einzelnen präimplantatorischen Embryonen qualitativ und quantitativ nachzuweisen. Die Erstellung komplexer Expressionsprofile aus biologischen Proben unterschiedlicher Herkunft kann mittels cDNA-Array-Technologie durchgeführt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Eignung von Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray zu untersuchen.   Mit Hilfe eines semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assays wurde der relative Gehalt folgender Gentranskripte, die in der Histondeacetylierung [Histone deacetylase2 (HDAC2)], Histonacetylierung [Histone acetyltransferase1 (HAT1)], Histonmethylierung [Histonmethyltransferasen (SUV39H1, G9A)], Heterochromatin-Entstehung [Heterochromatin Protein 1 (HP1)] und chromatinvermittelten Transkriptionsregulation [Zygote arrest 1 (ZAR1)], eine wichtige Rolle spielen, in Oozyten, Zygoten, 8-16-Zellern sowie Blastozysten untersucht. In die Analysen wurden in vitro fertilisierte [aus zwei verschiedenen Kultursystemen (TCM- und SOF-System)], in vivo gewonnene, geklonte mit adulten weiblichen und männlichen Fibroblasten als Spenderzellen, sowie parthenogenetisch aktivierte (diploides mütterliches Genom) Embryonen untersucht. Ausserdem wurden androgenetische Embryonen (diploides väterliches Genom) in die Analysen mit einbezogen. Für die semi-quantitative Endpunkt-RT-PCR-Analyse wurde Poly(A)+-RNA aus jeweils zwei Embryonen mit Hilfe eines Extraktionssystems (DYNABEADS mRNA DIRECT KIT®) isoliert. Die isolierte Poly(A)+-RNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von Random Hexamer-Primern und MuLV-Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Der optimierte Reaktionsablauf erfolgte durch den Einsatz von 0,5 Embryonenäquivalenten für ZAR1 und HP1, 0,6 für SUV39H1, 1,0 für HDAC2, 0,4 für HAT1 und 0,3 für G9A durch PCR-Amplifizierung der erhaltenen cDNA während der reverse Transkription. Als exogen hinzugegebender Standard diente Kaninchen-Globin-mRNA. Für jedes Embryonalstadium wurden 5-10 Wiederholungen durchgeführt, nachdem die Amplifikationsbedingungen für jedes genspezifisches Primerpaar zunächst optimiert worden waren. Für die quantitative Auswertung von PCR-Produkten war die Zyklenzahl zu definieren, in der die Amplifikationsphase exponentiell erfolgte. Für die untersuchten Gene wurde eine lineare Amplifikation zwischen 31-34 PCR-Zyklen ermittelt. Mit Hilfe eines humanen cDNA-Microarrays, der im Max Planck Institut in Berlin erstellt wurde, wurde eine Cross-species-Hybridisierung mit boviner RNA durchgeführt. Zum Nachweis der prinzipiellen Eignung dieses methodischen Ansatzes wurde Gesamt-RNA aus fetalem Gehirn von Mensch und Rind verwendet. Der humane cDNA-Microarray bestand aus 394 vollständig sequenzierten Genen aus einer humanen cDNA-Kollektion (Human Ensembl set RZPD1.1), die jeweils 20 Mal aufgetragen waren. Es wurden vier Hybridisierungen durchgeführt. Als endogener Standard dienten Haushaltsgene (Housekeeping gene) HPRT und ß-actin. Die Arrayergebnisse wurden für ausgewählte Gene, die unterschiedlich exprimiert waren mittels eines semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR-Assays verifiziert. Dazu gehörten Gene, die in der Zellzyklus-Kontrolle sowie in der eukaryontischen Genomreplikation beteiligt sind. Es wurden 3 Wiederholungen durchgeführt.   Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1.            Für die Gene MATER, NANOG, PEG3 und GCN5 konnte trotz vieler Optimierungsversuche kein optimales PCR-Protokoll erstellt wurden und es wurden keine weiteren Versuche zur Darstellung dieser Gene durchgeführt. 2.            Für die Gene ZAR1, HDAC2, SUV39H1, G9A, HP1 und HAT1 wurde ein optimiertes PCR-Protokoll ermittelt und unter Anwendung der zuvor optimierten PCR-Bedingungen konnte die mRNA-Expression dieser Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen werden: A.           ZAR1-mRNA fiel während der Eizellreifung und ebenso nach der Befruchtung signifikant ab. In Morulae und Blastozysten konnte das Transkript nicht nachgewiesen werden. Dies deutet auf ein auschliesslich maternales Expressionsmuster hin. B.           Ein signifikanter Abfall der HDAC2-mRNA konnte in Zygoten nach artifizieller Aktivierung, Befruchtung und nach somatischem Kerntransfer im Vergleich zu unreifen und gereiften Eizellen beobachtet werden. Unterschiede im Transkriptgehalt bestanden zwischen androgenetischen und parthenogenetischen, SOF- und Kerntransferblastozysten, die mit weiblichen Spenderzellen erstellt worden waren. C.           Der HAT1-Transkriptgehalt war zwischen unreifen Eizellen und solchen nach der Enukleation sowie nach Enukleation und Aktivierung signifikant unterschiedlich. HAT1-mRNA zeigte einen erhöhten Transkriptgehalt in Zygoten nach Kerntransfer, die mit weiblichen Spenderzellen erstellt worden waren, im Vergleich zu SOF-produzierten oder parthenogenetischen Zygoten, sowie solchen nach artifizieller Aktivierung. Im 8-16-Zell-Stadium sowie im Blastozystenstadium wurden keine Unterschiede im Transkriptgehalt nachgewiesen. D.           Die Histonmethyltransferasen SUV39H1, G9A und Heterochromatin Protein1 (HP1) zeigten einen signifikanten Abfall im Transkriptgehalt in Oozyten nach der Enukleation und nach artifizieller Aktivierung im Vergleich zu unreifen Eizellen. Weiterhin wiesen geklonte Zygoten, die mit weiblichen Spenderzellen erstellt worden waren, einen signifikant erhöhten Transkriptgehalt im Vergleich zu artifiziell aktivierten Eizellen auf. Unterschiede im Gehalt an SUV39H1-mRNA konnten auch zwischen geklonten Zygoten (weibliche Spenderzellen) und parthenogenetisch erstellten, sowie Zygoten aus dem SOF- und TCM-System nachgewiesen werden. Im 8-16-Zell-Stadium zeigten nur SUV39H1-Transkripte signifikante Unterschiede zwischen parthenogenetisch aktivierten Embryonen im Vergleich zu androgenetischen, in TCM- und SOF-produzierten Embryonen sowie solchen Embryonen, die mit weiblichen oder männlichen Spenderzellen erstellt worden waren. Im Blastozystenstadium war der relative Transkriptgehalt für die Histonmethyltransferasen (SUV39H1, G9A) und Heterochromatin Protein1 (HP1) signifikant unterschiedlich zwischen geklonten (männlichen Spenderzellen) und in vivo gewonnenen Embryonen. E.            Der HP1-mRNA-Gehalt unterschied sich zwischen geklonten Blastozysten mit männlichen Spenderzellen im Vergleich zu parthenogenetischen und mit weiblichen Spenderzellen geklonten Embryonen. Weiterhin unterschied sich der HP1-Transkriptgehalt zwischen SOF- und TCM-Blastozysten und in vivo gewonnenen Blastozysten. SUV39H1-mRNA war signifikant unterschiedlich zwischen parthenogenetisch aktivierten und SOF-erzeugten Blastozysten im Vergleich zu in vivo Blastozysten. Signifikante Unterschiede im Transkriptgehalt von G9A-mRNA wurden auch zwischen geklonten Blastozysten mit männlichen und weiblichen Spenderzellen nachgewiesen.   3.            Mittels Cross-species-Hybridisierung boviner RNA mit einem humanen cDNA-Array konnten fast 7000 Datenpunkte erstellt wurden, die dann für die statistische Auswertung verwendet wurden. A.           Der Korrelationskoeffizient für die Cross-Species-Hybridisierung der orthologen Gene betrug 0,94. B.           Es wurde der Korrelationskoeffizient für die Variabilität (CV) bei vier Hybridisationsdurchgängen herangezogen und damit wurden die Gene in vier CV-Kategorien zugeordnet. Gene, mit einem CV unterhalb von 0,25 wurden in Kategorie I (hohe Reproduzierbarkeit) eingestuft. Bei den Genen, die gut reproduzierbar waren (Kategorie II), lag der CV zwischen 0,25 und 0,5. In die Kategorie III (mittelmäßige Reproduzierbarkeit) fallen die Gene mit einem CV zwischen 0,5 und 0,75. Der Kategorie IV (schwache Reproduzierbarkeit) wurden die Gene mit einem CV oberhalb 0,75 zugeordnet. C.           Nach der Beurteilung der Expressionsintensität (BG-tag) wurden Gene in drei Kategorien untergeteilt worden: Kategorie I (niedrig, nicht detektierbar) betrug Gene, die einen geringeren BG-tag Wert als 0,8 aufwiesen, das waren 19 bei boviner mRNA und 17 bei humaner mRNA. Die Kategorie II (mittel), wo Gene mit BG-tag zwischen 0,8 und 0,9 liegen wurden 26 bovine und 17 humane Gene zugeordnet. In der Kategorie III (hohe Detektion) waren 304 bovine und 315 humane Gene D.           Sequenzvergleiche für die 349 gut charakterisierten humanen Gene mit homologen ESTs beim Rind ermöglicht es, zahlreiche Gene namentlich zuordnen. E.            Bei 16 Genen betrug die Homologie über 95%, bei 137 Genen lag sie zwischen 90% und 95% zu den humanen Sequenzen. 120 Gene besaßen eine Sequenzidentität von 85% bis 90% und 40 Gene eine zwischen 80% und 85%. Für 3 Gene konnte eine Homologie zwischen 75% und 80% gefunden werden. Insgesamt wurden 33 Gene ohne Homologie zu humanen Sequenzen gefunden. F.            Eine genspezifische Endpunkt-RT-PCR-Analyse mit bekannten Primersequenzen erlaubte eine Ko-Amplifikation sowohl der humanen als auch der bovinen orthologen Transkripte. Die erhaltenen Daten aus der Expressionsanalyse mittels cDNA-Microarray stimmten nur bedingt mit den Ergebnissen der Endpunkt-RT-PCR überein.   Der Nachweis von Genen, die an den Histonmodifikationen beteiligt sind, ergab Unterschiede zwischen Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft. Die Aufdeckung von Unterschieden im mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und in vitro produzierten oder geklonten Embryonen ist ein wesentlicher Schlüssel für Optimierung der In-vitro-Systeme und zur Minimierung des Auftretens von Entwicklungsstörungen. Dadurch konnte auch das Verständnis über die Expression von Genen, die an den Histonmodifikationen beteiligt sind, vertieft werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie können als wertvolles Modell für die assistierten Reproduktionstechnologien (ART) beim Menschen dienen, wo auch ein erhöhtes Risiko in Bezug auf abnormale Entwicklung nach Anwendung von ARTs besteht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch eine Cross-species-Hybridisierung boviner RNA mit einem heterologen Microarraysystem aussagekräftige Expressionsdaten erhalten werden können. Eine heterologe (zwischen verschiedenen Spezies) Genexpressionsanalyse kann in Zukunft als wichtiges Hilfsmittel für die Aufklärung evolutionär konservierter Mechanismen sowie von Signalen in der Kontrolle der Genexpression dienen.


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Nowak-Imialek, Monika Anna: Messenger RNA-Expressionsprofile histon-assoziierter Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen und Cross-species-Hybridisierung humaner und boviner orthologer Gene in einem High-density-cDNA-Microarray. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.


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