Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In-vitro- und In-vivo-Funktionsanalyse von hGM-CSF-Zytokinrezeptor-Varianten in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Odenbrett, Stephanie A.

The aim of this study was to examine the function of a cytokine receptor variant which was generated of the extracellular and transmembrane part of the α-chain from the receptor of the human granulocyte-macrophage-colonie-stimulating factor (hGMR) and the cytoplasmatic part of the β-chain from the hGMR (αβGMR) in murine hematopoetic stem and progenitor cells with regard to a pathogenetic relevance for the development of myeloproliferative diseases. It should be tested whether the αβGMR can be used for a respective mouse model as well as for the in vivo selection of transduced cells after bone marrow transplantation. Apart from the chimeric receptor αβGMR, a constitutive active β-chain of the hGMR with a substitution of valin with glutaminacid in the transmembrane part (βGMR V449E) and a constitutive active β-chain of the hGMR with a substitution of isoleucin with asparagin in the extracellular part (βGMR I374N) were investigated.   After transduction with the αβGMR, murine lineage-negative bone marrow cells were able to generate colonies in methylcellulose only in the presence of hGM-CSF. It was also possible to demonstrate the cytokine independent growth of colonies of murine lineage-negative bone marrow cells after transduction with the βGMR V449E and the βGMR I374N. The function of the transgenes for the αβGMR, the βGMR V449E and the βGMR I374N was demonstrated in vitro. For in vivo analyses of the function of the three receptor variants, bone marrow transplantations were performed in 74 mice using murine lineage-negative bone marrow cells after retroviral transduction.   Leukocytes containing the green fluorescend protein (GFP) were detetcted in transplantated and serial transplantated mice. The functionallity of the αβGMR was demonstrated in colony-assays. The transduced transgene was detected using a Real Time-DNA-PCR. The successful transduction and transplantation of hematopoietic stem cells were shown by serial transplantations.   Transplantated R780 αβGMR-mice received injections with hGM-CSF during the engraftment period and 5-33 weeks after transplantation. Subcutaneous injections with hGM-CSF had a significant effect on the white blood cell count of transplantated αβGMR-mice in one part of the in vivo experiments. Neither R780 αβGMR-mice nor V449E-mice developed a haematologic disease. Two of seven I374N-mice developed haematological changes (leukocytosis, erythrocytosis, thrombocytosis, increase of haemoglobin concentration and increase of haematocrit), suggesting a myeloproliferative disease. Thus, it was possible to induce a proliferative haematologic disease based on the protocol used in this work.   It may be possible to establish an model for inducible leukaemia by using transgene αβGMR-animals, which have a stable expression of the chimeric αβGMR. The degree of stimulation of the αβGMR is not sufficient to select transduced cells in vivo. This fact may be explained by the low transduction efficiency of the murine lineage-negative bone marrow cells and the high variation of the gene expression in vivo.

Ziel dieser Arbeit war es, die Rezeptorvariante aus dem extrazellulären und transmembranen Teil der α-Kette des Rezeptors für den humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hGMR) und dem zytoplasmatischen Teil der β-Kette des hGMR (αβGMR) in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen im Hinblick auf eine mögliche pathogenetische Bedeutung für die Entstehung von myeloischen Erkrankungen zu untersuchen und gegebenenfalls ein entsprechendes Mausmodell zu entwickeln. Weiterhin sollte die Eignung des αβGMR für die In-vivo-Selektion transduzierter Zellen nach einer Knochenmarkstransplantation geprüft werden. Neben dem chimären Rezeptor αβGMR wurde die konstitutiv aktive β-Kette des hGMR mit der Substitution von Valin durch Glutaminsäure in der Transmembranregion (βGMR V449E) und die konstitutiv aktive β-Kette des hGMR mit der Substitution von Isoleucin durch Asparagin in der Extrazellulärregion (βGMR I374N) untersucht.   Murine lineage-negative Knochenmarkszellen waren nach Transduktion mit dem αβGMR in der Lage, in Methylzellulose in ausschließlicher Gegenwart von hGM-CSF Kolonien zu bilden. Die Koloniebildung von murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen, die die βGMR V449E und die βGMR I374N exprimieren, konnte ohne Zugabe von Zytokinen ebenfalls im Kolonie-Assay gezeigt werden. Somit konnte die Funktionalität der Transgene für den αβGMR, die βGMR V449E und die βGMR I374N in vitro nachgewiesen werden. Zur In-vivo-Untersuchung der Funktion der drei verwendeten Zytokinrezeptorvarianten wurden insgesamt 74 Mäuse mit retroviral transduzierten, murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen transplantiert. Der Nachweis von Leukozyten, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) enthalten, gelang bei transplantierten und seriell transplantierten Tieren. Außerdem waren der funktionelle Nachweis des αβGMR im Kolonie-Assay und der Nachweis des übertragenen Transgens in einer Real Time-DNA-PCR möglich. Durch eine serielle Transplantation konnte die erfolgreiche Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Stammzellen nachgewiesen werden. Transplantierte R780 αβGMR-Mäuse wurden während des Engraftment und ab 5 Wochen nach der Knochenmarkstransplantion mit hGM-CSF behandelt. In einem Teil der In-vivo-Versuche war es möglich, einen signifikanten Effekt von subkutanen Injektionen mit hGM-CSF auf die Leukozytenzahl der Mäuse, die den chimären αβGMR exprimieren, nachzuweisen. Keine der R780 αβGMR-Mäuse und keine der sieben V449E-Mäuse erkrankten während der Durchführung dieser Arbeit an einer hämatologischen Erkrankung. Zwei von sieben I374N-Mäusen entwickelten Symptome (Leukozytose, Erythrozytose, Thrombozytose, Erhöhung der Hämoglobinkonzentration und Erhöhung des Hämatokrit), die mit einer myeloproliferativen Erkrankung vereinbar sind. Hier konnte daher mit dem in dieser Arbeit verwendeten Knochenmarkstransplantationsprotokoll eine proliferative hämatologische Erkrankung induziert werden.   Es könnte möglich sein ein Modell für eine induzierbare Leukämie zu etablieren, bei dem transgene αβGMR-Tiere, die den chimären αβGMR stabil exprimieren, verwendet werden. Für eine In-vivo-Selektion transduzierter Zellen nach Knochenmarkstransplantation ist die Stimulierbarkeit des αβGMR nicht ausreichend. Möglich Ursachen können unter anderem die geringe Transduktionseffizienz der murinen lineage-negativen Knochenmarkszellen und die großen Schwankungen der Genexpression in vivo sein.

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Odenbrett, Stephanie A.: In-vitro- und In-vivo-Funktionsanalyse von hGM-CSF-Zytokinrezeptor-Varianten in murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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