Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts-Interaktionen bei der Mastitis des Rindes

Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzelerkrankung in der Rinderproduktion, für die es bisher nur unbefriedigende Prophylaxe- und Therapiekonzepte gibt. Als Teil eines wissenschaftlichen Gesamtkonzeptes trägt die vorliegende Arbeit dazu bei, Mechanismen aufzuklären, die an der Pathogenese der Mastitis beteiligt sind. Dabei stehen Ereignisse und Mechanismen im Mittelpunkt des Interesses, die in der frühen Phase der Erreger-Wirts-Interaktionen eine Rolle spielen.   Mastitiden treten vermehrt in der peripartalen Phase des Rindes auf und werden in diesem Zeitraum oft durch die Erreger Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) hervorgerufen. Deshalb wurde in dieser Arbeit geprüft, ob Bestandteile der beiden Erreger (sog. PAMPs) unter dem Einfluss peripartal relevanter Sexualsteroide, die Funktionalität in-vitro-generierter Makrophagen beeinflussen. Ein sehr empfindlicher Parameter zur Charakterisierung der Funktionalität von Makrophagen stellt deren Eigenschaft dar, nach Stimulierung mit PAMPs, Faktoren zu sezernieren, welche zum Absterben neutrophiler Granulozyten führen.   In allen untersuchten bovinen Leukozytenpräparationen (neutrophile Granulozyten [PMN], mononukleäre Leukozyten [MNC], Monozyten, in-vitro-generierte Makrophagen [MdM]) konnten immunhistologisch und oder mittels PCR sowohl der Progesteronrezeptor als auch die Östrogenrezeptoren-α und –β nachgewiesen werden. Progesteron und Östradiol-17β führten hochdosiert zu einer signifikanten Senkung der Absterberate anteiliger PMN von einer CpG-stimulierten Gesamtleukozytenpopulation. LPS-stimulierte MdM konnten unter dem Einfluss von Östradiol-17β ein Absterben von PMN verstärken. Während Progesteron keinen Einfluss auf die Zahl reiner, vitaler PMN nach Stimulation mit PAMPs nahm, starben tendenziell mehr PMN in Anwesenheit des Hormons, wenn Kokulturen der Zellen mit MdM und LPS oder der Kombination von LPS und einem CpG-Motiv stimuliert wurden. Östradiol-17β hingegen verstärkte hochsignifikant das LPS-induzierte, MdM-abhängige Sterben der PMN, nicht aber das durch LPS und durch das CpG-Motiv additiv induzierte Sterben. MdM exprimieren die Erregerrezeptoren TLR-2 und TLR-4 (Toll-like-Rezeptor-2, -4) sowie das bovine β-Defensin 5 (BNBD5). Im Gegensatz zu Progesteron senkte Östradiol-17β nicht signifikant die Expression aller drei mittels quantitativer PCR untersuchter Gene. Damit konnte gezeigt werden, dass Hormone die Reaktionsfähigkeit von Immunzellen auf Erregerbestandteile modulieren können.   Um zu prüfen, ob bovine Makrophagen in ihrem Immunphänotyp polarisiert sein können, wurde der Arginin-Metabolismus näher analysiert. Erstmals wurde das Enzym Arginase in bovinen MdM und MNC nachgewiesen. Eine Induktion seiner Aktivität erfolgte bereits während der Kultivierung und ließ sich durch Stimulation mit LPS nicht signifikant steigern. Eine abhängige Regulation konnte für bovine MdM nicht gezeigt werden: Während LPS eine signifikante Steigerung der NO-Produktion hervorrief, zeigten sich keine Korrelationen der Arginase-Aktivität. Während im murinen System die Regulation der alternativen Schlüsselenzyme induzierbare NO-Synthase (pro-inflammatorisch) und Arginase (anti-inflammatorisch) meist streng dichotom erfolgt, galt dies nicht für bovine Zellen. Der Arginin-Metabolismus beim Rind kann daher nicht als Hinweis auf einen vorherrschenden Immunphänotyp dienen.   Ein Kernpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Mastitis-Infektionsmodells für das Rind. Unter streng definierten Bedingungen soll damit die frühe Phase (24-72 h) einer akuten klinischen (E. coli) sowie einer subklinisch bis chronischen (S. aureus) Mastitis simuliert werden. Die anschließende Quantifizierung von Entzündungszellen im Sekret zu unterschiedlichen Zeiten der Infektion, deren durchflusszytometrische Erfassung und Differenzierung, sowie die Messung der TLR-Expression und β-Defensingenexpression im Eutergewebe und in Lymphknoten mittels quantitativer RT-PCR sollten Mechanismen der frühen Infektionsabwehr näher charakterisieren. Die Qualität des entwickelten Mastitismodells begründet sich einerseits im straffen Vorabscreening der Versuchstiere (Rasse: Holstein-Friesian, 1. Laktation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <100.000 Zellen/ml über mindestens zwei Wochen vor Versuchsbeginn). Andererseits wurden während der simulierten Mastitis regelmäßig die Körpertemperatur, die Milchleistung, die Eutersekretbeschaffenheit, der Euterpalpationsbefund, das Allgemeinbefinden und das Differentialblutbild dokumentiert. Erste mit Hilfe des Modells erhobene Daten waren:   Alle mit E. coli infizierten Tiere reagierten mit Fieber innerhalb von 12 h. Bei den mit S. aureus über 24 und 72 h infizierten Tieren war keine signifikante Erhöhung der Körpertemperatur festzustellen. Die tägliche Milchleistung sank sowohl bei Tieren, die mit E. coli als auch mit S. aureus infiziert wurden signifikant entsprechend der Versuchszeiträume. Alle mit E. coli infizierten Tiere zeigten innerhalb des 24-stündigen Experiments geringgradige Störungen des Allgemeinbefindens, hochgradige Veränderungen des Eutersekretes (Flocken, Verlust des Milchcharakters) und eine hochgradige entzündliche Schwellung betroffener Euterviertel. Tiere, die mit S. aureus infiziert wurden, zeigten hingegen keine bis geringgradige klinische Anzeichen einer Mastitis. Im Gegensatz zu den 24-stündigen Infektionen mit S. aureus, zeigten die über 72 h infizierten Tiere i.d.R. deutlichere Symptome einer klinischen Mastitis (zunehmende Flockenbildung in der Milch bei erhaltenem Milchcharakter). Bei allen Tieren, die mit E. coli infiziert wurden, war bereits nach 12 h eine signifikante Leukopenie, mit Neutropenie und Lymphopenie zu beobachten. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus wurden keine signifikanten Veränderungen der Zahl zirkulierender Leukozyten beobachtet. Hingegen kam es bei einer 72-stündigen Infektion zu einem transienten, signifikanten Abfall der PMN 48 h post infectionem. Sowohl E. coli als auch S. aureus konnten aus den zuvor infizierten Eutervierteln reisoliert werden. Nach Infektion mit E. coli ließ sich ein markanter, signifikanter Anstieg des SCC bereits 12 h post infectionem feststellen. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus war eine nur schwache, jedoch signifikante SCC-Erhöhung in Versuchs- und Kontrollvierteln nachzuweisen. Bei den über 72 h dauernden Infektionen mit S. aureus war die SCC-Dynamik sehr heterogen: Bei vier Tieren war ein signifikanter SCC-Anstieg zu beobachten, bei zwei Tieren nicht. Nach Infektion mit E. coli oder S. aureus stieg der Anteil neutrophiler Granulozyten in der Milch und blieb im weiteren Verlauf der Infektion erhöht. Es wurde eine starke positive Korrelation zwischen SCC-Wert und absoluter PMN-Zahl in der Milch gefunden. Es konnten keine signifikanten Unterschiede der Zusammensetzung zwischen untersuchten Viertelanfangs- und –endgemelken nachgewiesen werden. Eine sequentielle Infektion konnte aufzeigen, dass eine vorangegangene Infektion die Reaktionsbereitschaft auf nachfolgende Infektionen beeinflusst. Eine zweite Infektion nach 12 h mit E. coli konnte keine Erhöhung der Zellzahl herbeiführen. Ein zunächst heterogener SCC-Anstieg nach Infektion mit S. aureus verursachte 60 h später eine verbesserte, einheitliche Reaktionsbereitschaft. Grundsätzlich konnte die Expression der TLR-2, -3, -4, -6 sowie auch boviner β-Defensine (insbesondere des BNBD5) in allen untersuchten Eutervierteln, sowie in Euter- und Buglymphknoten nachgewiesen werden. Eine signifikante Hochregulation der Expression konnte für TLR-2 und –4, sowie für bovine β-Defensine nach Infektion mit E. coli in den infizierten Eutervierteln, den Euterlymphknoten und teilweise in den somatischen Zellen des Milchsekrets gezeigt werden. S. aureus bewirkte erst nach 72-stündiger Infektion und lediglich bei den β-Defensinen eine signifikante Expressionssteigerung in den Euterlymphknoten beider Seiten.   Mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit erstellten Mastitismodells wurden orientierte Daten zur Einschätzung der Bedeutung von Erreger-Erkennungs-Rezeptoren für frühe Erreger-Wirts-Interaktionen in der Milchdrüse erlangt. Nach Erweiterung des Untersuchungsspektrums steht damit ein Instrument zur Verfügung, das zur Klärung einer ganzen Reihe spezifischer Fragestellungen zur Pathogenese von Mastitiden eingesetzt werden kann. Folgeexperimente dieser Arbeit werden vor allem Problemstellungen zur Bedeutung unterschiedlich hoher Milchzellzahlen auf die frühen Erreger-Wirts-Mechanismen, die Krankheitsverläufe nach Einsatz von Erregerstämmen mit unterschiedlichen Pathogenitätseigenschaften, aber vor allem auch molekularen Grundlagen von Infektions- und initialen Abwehrmechanismen in der Milchdrüse anhand Transkriptom- und Proteomanalysen beinhalten. Erworbene Erkenntnisse werden als Grundlage zur Definition neuer Parameter für das Merkmal „Eutergesundheit“ dienen. Langfristig sollen neue Kandidatengene für die Zucht von Kühen mit verbessertem Immunschutz identifiziert und funktionell validiert werden.