Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Kinetische Untersuchungen zur in vitro Kapazitation und Zona pellucida-induzierte Akrosomreaktion am Eberspermatozoon

Piehler, Erik Olaf

The aim of this study was to characterize quantitatively the main physiological processes related to the capacitation of boar spermatozoa and order them sequentially. Furthermore, it should be tested whether the modification of zona pellucida during in vitro maturation of oocytes affects the capability of zona pellucida to induce acrosome reaction. In order to perform the kinetic characterization of the capacitation process, the functional changes in diluted and 24-h stored spermatozoa have been observed for 180 minutes during incubation under capacitating conditions. The dynamic changes in the cytosolic calcium ion content, in the overall  phosphorylation of the tyrosine residues of sperm proteins und in the spontaneous acrosome reaction were examined in live sperm suspensions by means of flow cytometry. For investigation of effect of maturation state of oocytes on the induced acrosome reaction, zonae pellucidae were collected from ovaries of gilts slaughtered at the local abattoir. Then zona pellucida was either isolated directly from the collected oocytes (GV) or after in vitro maturation of oocytes (48 h). The experiments were organized in two sections: First, the effect of zona pellucida glycoproteins on porcine spermatozooa under capacitating conditions was examined using a flow cytometer. As marker were used the cytosolic concentration of calcium ions, the phosphorylation of tyrosine residues of sperm proteins and the induced acrosome reaction. Subsequently, the effects of intact zona pellucida from oocytes at different state of maturation were examined on the time course of acrosome reaction and on the changes in the cytosolic calcium ion content in frozen-thawed spermatozoa. The investigation of acrosome reaction process on the intact zona pellucida was performed by means of confocal laser scanning microscope.                                                 Following results were obtained: 1.        The dynamic flow cytometric analysis supports the notion that the sequence of processes related to the in vitro capacitation of boar spermatozoa is specifically ordered. The markedly increase in cytosolic calcium ion content is followed by the massive overall rise in protein phosphorylation of tyrosine residues in live sperm suspensions. These both events precede the initiation of spontaneous acrosome reaction and appear therefore to be related to the capacitation process.  2.        The effect of zona pellucida on the processes occurring during capacitation in sperm populations depends on the maturation state of the oocytes. Zonae pellucidae collected from in vitro matured oocytes induced an acceleration of the examined processes. 3.        Within used experimental system, intact zonae pellucidae had a stronger effect on the examined processes in cryopreserved spermatozoa than solubilized zona pellucida glycoproteins in liquid-preserved spermatozoa. These results let suggest that the biochemical and structural modifications of the zona pellucida occurring during in vitro maturation correlate with the functional properties of the zona pellucida. Due to the apparent amplified effects of the intact zona pellucida on the capacitation-related processes in comparison with the effects of zona pellucida glycoproteins it appears that the three-dimensional structure of the ligands of the zona pellucida is another key factor besides the maturation-conditioned modification. The role of in vivo maturation of the oocyte on the functionality of zona pellucida has to be clarified in further studies on zona pellucida and on zona pellucida-glycoproteins.

Das Ziel dieser Arbeit war, Prozessabläufe während der Kapazitation der Spermatozoen näher zu charakterisieren und in einen zeitlichen Zusammenhang zu bringen. Desweiteren sollte geprüft werden, ob Veränderungen der Zona pellucida während der in vitro Eizellreifung sich auf die Fähigkeit, die Akrosomreaktion zu induzieren, auswirken. Um die Kapazitation näher zu untersuchen, wurden 24 Stunden gelagerte Spermien unter kapazitierenden Bedingungen inkubiert und über einen Messzeitraum von 180 Minuten beobachtet. Am Durchflusszytometer wurden der intrazelluläre Kalziumionengehalt, die Tyrosinphosphorylierung und die spontane Akrosomreaktion parallel untersucht. Um den Einfluss der Zona pellucida auf die Akrosomreaktion des Spermatozoons näher zu untersuchen, wurden zunächst Zonae pellucidae gewonnen. Als Untersuchungsmaterial standen Ovarien frisch geschlachteter Jungsauen zur Verfügung. Nach der Gewinnung der Oozyten wurde entweder die Zona pellucida direkt isoliert oder die Oozyten wurden zunächst einer in vitro Maturation unterzogen. Die Untersuchungen gliederten sich in zwei Versuchsabschnitte: Erstens wurde mit Hilfe des Durchflusszytometers der Effekt von Zona pellucida-Glykoproteinen auf porcine Spermatozoen unter kapazitierenden Bedingungen untersucht. Als Marker wurden der intrazelluläre Kalziumionengehalt, die Tyrosinphosphorylierung und die Akrosomreaktion verwendet. Zweitens wurden die Effekte intakter Zonae pellucidae unterschiedlicher Eizellreifestadien auf kryokonservierte Spermatozoen anhand der Akrosomreaktion und des intrazellulären Kalziumionengehaltes untersucht. Als bildgebendes Mittel wurde zum Nachweis der Akrosomreaktion ein konfokales Fluoreszenzmikroskop verwendet.                                                 Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1.        Die durchflusszytometrische Analyse ergab, dass die Sequenz der Prozesse während der Kapazitation beim Schwein spezifisch ist. Die Prozesse laufen nacheinander in unterschiedlichen Zeitfenstern ab. Zuerst findet die Erhöhung des intrazellulären Kalziumionengehaltes und danach folgt die Tyrosinphosphorylierung von Spermienproteinen. 2.        Die Zona pellucida hat abhängig von ihrem Reifungsgrad einen unterschiedlich deutlichen Effekt auf die untersuchten Vorgänge am Spermatozoon. Zonae pellucidae gereifter Oozyten bewirkten eine Beschleunigung der untersuchten Prozessabläufe. 3.        Im getesteten System übten intakte Zonae pellucidae einen deutlich ausgeprägteren Effekt auf die untersuchten Prozesse der kryokonservierten Spermatozoen als Zona pellucida-Glykoproteine auf flüssigkonservierte Spermatozoen aus. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, dass die Zona pellucida reifungsbedingten Umbauprozessen unterliegt, die die Funktionalität der Zona pellucida steigern. Da die intakte Zona pellucida einen größeren Effekt auf die Prozesse als Zona pellucida-Glykoproteine hat, muss davon ausgegangen werden, dass die dreidimensionle Anordnung und Präsentation der Ligandenstrukturen der Zona pellucida ebenso wichtig sind wie die Umbauprozesse während der in vitro Maturation. Inwiefern die in vivo Maturation der Eizelle die Funktionalität der Zona pellucida beeinflusst und in welchem Maße, sollten weitere Untersuchungen mit Zona pellucida oder Zona pellucida-Glykoproteinen in vivo gereifter Eizellen klären.

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Piehler, Erik Olaf: Kinetische Untersuchungen zur in vitro Kapazitation und Zona pellucida-induzierte Akrosomreaktion am Eberspermatozoon. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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