Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender durch In-vitro-Reifung auf Granulosazellmonolayern adulter Tiere

Ponebšek, Simona

Oocytes from prepubertal calves show decreased developmental capacity with regard to cleavage and blastocysts rate compared with oocytes from adult animals. It is likely that this is due to incomplete cytoplasmatic maturation. The goal of the present study was to improve the developmental competence of juvenile oocytes by maturing them on granulosa cell (GC) monolayers from adult animals. Therefore numbers of suitable oocytes for IVP, cleavage and blastocysts rates were determined and compared with oocytes from adult animals. For this study 46 Holstein Frisian calves at 7-8 months of age underwent OPU twice per week in six consecutive OPU-sessions. Based on previous experiments the calves received an i.m. injection of FSH 48 hours prior to each OPU-session. Oocytes obtained from 18 lactating cows served as controls and were matured without co-culture. Granulosa cells for the monolayers were isolated from the follicles of bovine ovaries obtained from a commercial abattoir. The cells were washed and sewed in culture dishes. After five days they grew to a 70-80% confluent monolayer and could be aliquoted. The aliquots were frozen at -80°C. For the whole experiment aliquots from one charge were used. IVP suitable calf oocytes of morphological classes I-III were matured for 24 hours on either GC, fibroblasts or without co-culture in a standard medium (TCM199 with BSA supplement and hCG and eCG) before they were fertilised in Fert-Talp with heparin, hypotaurine and epinephrine. Fertilisation was carried out using frozen-thawed semen from one IVF tested bull. After 20-24 hours presumptive zygotes were mechanically denuded using a mouth pipette and cultured in SOF medium supplemented with BSA for 7-8 days. A possible influence of the different maturation methods on the mRNA expression of three developmental important genes, growth differentiation factor-9 (GDF-9), heat shock protein 70 (Hsp.70) and glucose transporter 3 (Glut-3) was investigated by semi quantitative RT-PCR assays . Single immature and mature oocytes (GDF-9 and Hsp.70), 8-16 cell embryos and expanded blastocysts of day 7 and day 8 (Hsp.70 and Glut-3) were investigated. The following results are obtained: 1)Similar results were obtained from calves and cows with regard to numbers of punctured follicles, numbers of obtained COCs and suitable COCs per animal. Seasonal differences were not found. The bodyweight of the calves at the beginning of the session had no influence on the results obtained. 2)The cleavage rate was significantly higher (P≤ 0.05) in oocytes derived from cows and calves matured on GC (74.3% and 70.0%, respectively) than in oocytes derived from the group without co-culture and the fibroblast groups (55.2% and 53.6%, respectively). 3)Blastocyst rates were similar in oocytes derived from cows and calves matured on GC (22.3% and 22.3%, respectively) but significantly higher (P≤ 0.05) than the group without co-culture and the fibroblast groups (11.7% and 5.5%, respectively). 4)Cell numbers of expanded blastocysts derived from calf oocytes matured on GC and from adult cows were significantly higher than in the group matured without co-culture and the fibroblast group (114.8 ± 7.9 and 118.7 ± 15.5 vs. 96.2 ± 4.6 and 95.0 ± 4.6, respectively). 5)After maturation, a significant (P≤ 0.05) decrease in Hsp.70 expression was observed. Expanded blastocysts derived from adult oocytes expressed Hsp.70 significantly more than blastocysts derived from oocytes of the control calves. 6)After maturation, a significant decrease in GDF-9 expression was observed in calf oocytes. Matured cow oocytes showed a significantly higher mRNA abundance of GDF-9 than matured calf oocytes 7)The relative abundance of Glut-3 was similar in 8-16 cell embryos and expanded blastocysts in all groups. The overall mRNA expression patterns for Hsp.70 and Glut-3 in blastocysts from GC matured oocytes were similar to that of cow blastocysts. These results indicate that the maturation of juvenile calf oocytes on granulosa cells from adult animals improves their developmental competence and that bovine embryos from prepubertal oocytes, after they switch to the embryonic genome, do show only a few differences in relative abundance for some developmental important genes. These findings provide clues towards identification of factors critically involved in acquiring full developmental capacity at puberty.

Oozyten präpuberaler Kälber weisen im Vergleich zu Oozyten von Kühen, eine niedrigere Entwicklungskompetenz im Hinblick auf Teilungs- und Blastozystenrate, auf. Ursachen dafür werden vor allem in der mangelhaften zytoplasmatischen Reifung der Kälberoozyten vermutet. Ziel dieser Arbeit war, durch Reifung boviner Oozyten juveniler Spender auf Granulosazellmonolayern von adulten Tieren die Entwicklungskapazität der Oozyten zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 46 Kälber im Alter zwischen 7-8 Monaten zweimal wöchentlich in sechs auf einander folgenden Ovum-pick-up (OPU)-Sitzungen punktiert. Basierend auf den Ergebnissen vorausgegangener Untersuchungen wurde den Kälbern 48 Stunden vor jeder OPU-Sitzung FSH i.m. appliziert. Oozyten von 18 laktierenden Kühen dienten als Kontrolle und wurden ohne Kokultur gereift. Für die Gewinnung von Granulosazellen adulter Spender wurden Rinderovarien mit Gelbkörpern aus einem kommerziellen Schlachthof verwendet. Die Zellen wurden gewaschen und in Kulturschalen ausgesät. Aliquots wurden bei -80°C eingefroren. Für die gesamte Versuchsreihe wurden Aliquots einer Charge (Granulosazellen eines Gewinnungstages) verwendet. IVF-taugliche Oozyten von Kälbern, der morphologischen Klassifizierung Klasse I-III, wurden 24 Stunden auf Granulosazell- oder Fibroblastenmonolayern in einem Standardmedium (TCM199 substituiert mit BSA, hCG und eCG) gereift und die Kumulusexpansion wurde beurteilt, bevor sie in Fert-Talp (substituiert mit Heparin, Hypotaurin, Epinephrin und BSA) in vitro fertilisiert wurden. Dazu wurde Tiefgefriersperma eines Bullen verwendet, dessen IVF-Tauglichkeit nachgewiesen war. Nach 18-20 Stunden wurden die Zygoten mechanisch mit einer Mundpipette von den noch anhaftenden Kumuluszellen befreit und anschließend in SOF mit BSA-Zusatz für 7-8 Tage kultiviert. Es wurde die Gesamtzahl IVF-tauglicher Oozyten sowie die Teilungs- und Blastozystenraten erfasst, und mit denen adulter Tiere verglichen. Der mögliche Einfluss der verschiedenen Reifungsmethoden auf die mRNA-Expression von drei entwicklungsrelevanten Genen, GDF-9, Hsp.70 und Glut-3, wurden mit Hilfe eines semi-quantitativen RT-PCR Assays bei einzelnen ungereiften und gereiften Oozyten (GDF-9 und Hsp.70) sowie frühen Teilungsstadien (8-16 Zellern) und expandierten Blastozysten (Hsp.70 und Glut-3) von Kälbern und Kühen, erfasst. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1)Bei Kälbern und Kühen wurden ähnliche Punktionsergebnisse im Hinblick auf die Anzahl punktierter Follikel, gewonnener KOKs und IVF- tauglicher KOKs pro Tier erzielt. Jahreszeitliche Unterschiede in den Punktionsergebnissen waren nicht festzustellen. Das Gewicht der Tiere zu Beginn der Punktion hatte keinen Einfluss auf die Punktionsergebnisse. 2)Es wurden signifikant höhere (p≤0,05) Teilungsraten bei den auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten (70,0%) und den Eizellen von adulten Tieren (74,3%) erzielt als bei den auf Fibroblasten gereiften Kälberoozyten (53,6%) und der Gruppe von Kälberoozyten ohne Kokultur (55,2%). 3)Die Blastozystenraten bei den auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten und den von adulten Tieren (22,3% und 22,3%) waren signifikant höher (p≤0,05) als für die auf Fibroblasten (5,5%) und die ohne Kokultur gereiften (11,7%) Kälberoozyten. 4)Die Zellzahlen expandierter Blastozysten der auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten (114,8 ± 7,9) und die von adulten Tieren (118,7 ± 15,5) unterschieden sich signifikant (p≤0,05) von expandierten Blastozysten aus Kälberooyzten der Gruppe ohne Kokultur (96,2 ± 4,6) und den aus auf Fibroblasten (95,0 ± 4,6) gereiften Kälberoozyten. 5)Nach der Reifung war ein signifikanter Abfall im relativen Transkriptgehalt von Hsp.70 in allen Reifungsgruppen festzustellen. Expandierte Blastozysten von Kühen wiesen signifikant (p£ 0,05) höhere relative Transkriptmengen pro Zelle auf als expandierte Blastozysten von Kälbern, die ohne Kokultur inkubiert wurden. 6)GDF-9 zeigte bei allen Versuchsgruppen nach der Eizellreifung einen signifikanten Abfall in der Expression. Gereifte Oozyten von Kühen wiesen eine signifikant höhere (p£ 0,05) Expression von GDF-9 als greifte Oozyten der Kälber. 7)Frühe Teilungsstadien (8-16 Zeller) und expandierte Blastozysten zeigten in allen untersuchten Gruppen ähnliche relative Transkriptgehalte für Glut-3 mRNA. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reifung von Oozyten präpuberaler Kälber auf Granulosazellen adulter Tiere die Entwicklungskompetenz deutlich verbessert. Sie bestätigen aber auch, dass bovine Embryonen präpuberaler Tiere im Vergleich zu Embryonen von adulten Tieren nach dem Umschalten auf das embryonale Genom nur noch wenige Unterschiede im relativen Transkriptgehalt einiger entwicklungsrelevanter Gene aufweisen. In zukünftigen Forschungsarbeiten sind weitere Faktoren zu identifizieren, mit denen die Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender weiter erhöht und charakterisiert werden kann.

Quote

Citation style:

Ponebšek, Simona: Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender durch In-vitro-Reifung auf Granulosazellmonolayern adulter Tiere. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export