Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender durch In-vitro-Reifung auf Granulosazellmonolayern adulter Tiere

Oozyten präpuberaler Kälber weisen im Vergleich zu Oozyten von Kühen, eine niedrigere Entwicklungskompetenz im Hinblick auf Teilungs- und Blastozystenrate, auf. Ursachen dafür werden vor allem in der mangelhaften zytoplasmatischen Reifung der Kälberoozyten vermutet. Ziel dieser Arbeit war, durch Reifung boviner Oozyten juveniler Spender auf Granulosazellmonolayern von adulten Tieren die Entwicklungskapazität der Oozyten zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 46 Kälber im Alter zwischen 7-8 Monaten zweimal wöchentlich in sechs auf einander folgenden Ovum-pick-up (OPU)-Sitzungen punktiert. Basierend auf den Ergebnissen vorausgegangener Untersuchungen wurde den Kälbern 48 Stunden vor jeder OPU-Sitzung FSH i.m. appliziert. Oozyten von 18 laktierenden Kühen dienten als Kontrolle und wurden ohne Kokultur gereift. Für die Gewinnung von Granulosazellen adulter Spender wurden Rinderovarien mit Gelbkörpern aus einem kommerziellen Schlachthof verwendet. Die Zellen wurden gewaschen und in Kulturschalen ausgesät. Aliquots wurden bei -80°C eingefroren. Für die gesamte Versuchsreihe wurden Aliquots einer Charge (Granulosazellen eines Gewinnungstages) verwendet. IVF-taugliche Oozyten von Kälbern, der morphologischen Klassifizierung Klasse I-III, wurden 24 Stunden auf Granulosazell- oder Fibroblastenmonolayern in einem Standardmedium (TCM199 substituiert mit BSA, hCG und eCG) gereift und die Kumulusexpansion wurde beurteilt, bevor sie in Fert-Talp (substituiert mit Heparin, Hypotaurin, Epinephrin und BSA) in vitro fertilisiert wurden. Dazu wurde Tiefgefriersperma eines Bullen verwendet, dessen IVF-Tauglichkeit nachgewiesen war. Nach 18-20 Stunden wurden die Zygoten mechanisch mit einer Mundpipette von den noch anhaftenden Kumuluszellen befreit und anschließend in SOF mit BSA-Zusatz für 7-8 Tage kultiviert. Es wurde die Gesamtzahl IVF-tauglicher Oozyten sowie die Teilungs- und Blastozystenraten erfasst, und mit denen adulter Tiere verglichen. Der mögliche Einfluss der verschiedenen Reifungsmethoden auf die mRNA-Expression von drei entwicklungsrelevanten Genen, GDF-9, Hsp.70 und Glut-3, wurden mit Hilfe eines semi-quantitativen RT-PCR Assays bei einzelnen ungereiften und gereiften Oozyten (GDF-9 und Hsp.70) sowie frühen Teilungsstadien (8-16 Zellern) und expandierten Blastozysten (Hsp.70 und Glut-3) von Kälbern und Kühen, erfasst. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1)Bei Kälbern und Kühen wurden ähnliche Punktionsergebnisse im Hinblick auf die Anzahl punktierter Follikel, gewonnener KOKs und IVF- tauglicher KOKs pro Tier erzielt. Jahreszeitliche Unterschiede in den Punktionsergebnissen waren nicht festzustellen. Das Gewicht der Tiere zu Beginn der Punktion hatte keinen Einfluss auf die Punktionsergebnisse. 2)Es wurden signifikant höhere (p≤0,05) Teilungsraten bei den auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten (70,0%) und den Eizellen von adulten Tieren (74,3%) erzielt als bei den auf Fibroblasten gereiften Kälberoozyten (53,6%) und der Gruppe von Kälberoozyten ohne Kokultur (55,2%). 3)Die Blastozystenraten bei den auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten und den von adulten Tieren (22,3% und 22,3%) waren signifikant höher (p≤0,05) als für die auf Fibroblasten (5,5%) und die ohne Kokultur gereiften (11,7%) Kälberoozyten. 4)Die Zellzahlen expandierter Blastozysten der auf Granulosazellen gereiften Kälberoozyten (114,8 ± 7,9) und die von adulten Tieren (118,7 ± 15,5) unterschieden sich signifikant (p≤0,05) von expandierten Blastozysten aus Kälberooyzten der Gruppe ohne Kokultur (96,2 ± 4,6) und den aus auf Fibroblasten (95,0 ± 4,6) gereiften Kälberoozyten. 5)Nach der Reifung war ein signifikanter Abfall im relativen Transkriptgehalt von Hsp.70 in allen Reifungsgruppen festzustellen. Expandierte Blastozysten von Kühen wiesen signifikant (p£ 0,05) höhere relative Transkriptmengen pro Zelle auf als expandierte Blastozysten von Kälbern, die ohne Kokultur inkubiert wurden. 6)GDF-9 zeigte bei allen Versuchsgruppen nach der Eizellreifung einen signifikanten Abfall in der Expression. Gereifte Oozyten von Kühen wiesen eine signifikant höhere (p£ 0,05) Expression von GDF-9 als greifte Oozyten der Kälber. 7)Frühe Teilungsstadien (8-16 Zeller) und expandierte Blastozysten zeigten in allen untersuchten Gruppen ähnliche relative Transkriptgehalte für Glut-3 mRNA. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reifung von Oozyten präpuberaler Kälber auf Granulosazellen adulter Tiere die Entwicklungskompetenz deutlich verbessert. Sie bestätigen aber auch, dass bovine Embryonen präpuberaler Tiere im Vergleich zu Embryonen von adulten Tieren nach dem Umschalten auf das embryonale Genom nur noch wenige Unterschiede im relativen Transkriptgehalt einiger entwicklungsrelevanter Gene aufweisen. In zukünftigen Forschungsarbeiten sind weitere Faktoren zu identifizieren, mit denen die Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender weiter erhöht und charakterisiert werden kann.