Untersuchungen zur Implementierung des Bouillon-Mikrodilutionsverfahrens zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen

Die in-vitro Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Infektionserreger ist für den zielgerichteten Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen sowie für ein aussagekräftiges Resistenzmonitoring unerlässlich. Die Ermittlung quantitativer Daten in Form von Minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werten) mittels Bouillon-Mikrodilution wird hierfür als Methode der Wahl angesehen. Mit dem Standard M31-A2 (2002) wurde durch das Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), vormals National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) eine international anerkannte Durchführungsvorschrift vorgelegt, die erstmals veterinärmedizinische Grenzwerte enthält und somit eine Klassifizierung der getesteten Infektionserreger anhand ihrer MHK-Werte erlaubt. Die Implementierung dieses Verfahrens in die Routinediagnostik ist damit insbesondere für akkreditierte Laboratorien von großem Interesse. Bei der Beimpfung der Mikrotiterplatten für das Bouillon-Mikrodilutionsverfahren ist gemäß CLSI Standard eine Einsaatdichte von 5 x105 KBE/ml zu erreichen. Eine beschriebene Methode hierzu ist die Einstellung der Bakteriensuspension mittels Densitometer. In der vorliegenden Studie wurde anhand von Referenz- und Typstämmen durch regressionsanalytische Auswertung der Abhängigkeit zwischen optischen Dichten und Lebendkeimzahlen alternativ dazu ein Wert erarbeitet, mit dessen Hilfe die Einstellung des Inokulums mit einem Photometer möglich ist. Hierfür wird von der Bakteriensuspension eine 1:10 Verdünnung hergestellt und von dieser die optische Dichte bestimmt. Der in dieser Studie ermittelte Wert für die „gewünschte optische Dichte“ beträgt 0,00027. Bei dem Vergleich von Ergebnissen aus Empfindlichkeitsprüfungen klinischer Isolate mittels Agardiffusionsverfahren und paralleler Testung mittels Bouillon-Mikrodilutionsverfahren konnte die Korrelation solcher Werte bestätigt werden. Die Methoden der Empfindlichkeitsprüfungen wurden hierbei gemäß den Vorschriften des CLSI (NCCLS M31-A2 2002) durchgeführt. Bei den meisten antimikrobiellen Wirkstoffen kam es zu Fehlerquoten unter 10% bei den größtmöglichen Fehlern („very major errors“). Bei der Bewertung von Ergebnissen aus Empfindlichkeitsprüfungen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen, für die keine validen Grenzwerte bei der gewählten Indikation zur Verfügung stehen, kam es zu häufigeren Fehlern. Die Untersuchung von Cephalothin ergab gegenüber Staphylokokken in 20,3% und gegenüber Enterobacteriaceae in 18,4% der Fälle „very major errors“. Bei Apramycin kam es gegenüber Enterobacteriaceae bei 46% der Testergebnisse zu „very major errors“. Der Materialvergleich zwischen den Mikrotiterplatten von zwei Herstellerfirmen im Rahmen der vorliegenden Studie ergab Unterschiede in den Ergebnissen der Isolate von durchschnittlich 5%. Die Mikrotiterplatten wurden mit klinischen Isolaten gemäß Herstellervorschriften und den Vorgaben des Standards M31-A2 des CLSI (NCCLS 2002) in verschiedenen Ansätzen untersucht. Die Abweichungen waren im Wesentlichen unabhängig von der Inokulumdichte und sie waren bei den verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen unterschiedlich hoch. Bei 13 Wirkstoffen traten nur geringfügige Abweichungen (0 - 4,5%) auf, bei Tetracyclin, Tiamulin und Erythromycin lagen Abweichungen von 6,8 - 11,4% und bei Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin von 13,6 - 47,7% vor. Bei einigen Erreger-Wirkstoff Kombinationen gab es auffällige Abweichungen, die sich ebenfalls auf die drei Antibiotika Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin konzentrierten. Bei einer der beiden Herstellerfirmen unterschieden sich die Ergebnisse zweier Testansätze auch untereinander. Die Unterschiede in den ermittelten MHK-Werten wirkten sich bei Spectinomycin auch auf die daraus resultierende Einordnung in die qualitativen Kategorien aus. Die im CLSI Standard M31-A2 (NCCLS 2002) zur Qualitätssicherung empfohlenen Referenzstämme wurden bei den Empfindlichkeitsprüfungen mitgeführt. Die ermittelten MHK-Werte lagen dabei bis auf einen Fall in den Referenzbereichen. Da es sich bei den verwendeten Mikrotiterplatten um diagnostische Platten handelt, sind einige MHK-Reihen verkürzt, wodurch nicht alle Referenzstämme in jedem Grenzbereich eindeutige Ergebnisse liefern. Die auffälligen Abweichungen bei Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin wurden anhand der Testung klinischer Isolate von Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica und Stapyhlococcus spp. deutlich, während die mitgeführten Referenzstämme noch in den Referenzbereichen lagen. Um die Konzentrationen der Wirkstoffe adäquat zu überprüfen, müssen demzufolge unbedingt mehrere geeignete Referenzstämme zur Qualitätskontrolle mitgeführt werden. Des Weiteren könnte die Qualitätskontrolle mit sensibleren Indikatororganismen sinnvoll ergänzt werden, wodurch auch die Grenzwerte im sensiblen Bereich einiger antimikrobieller Wirkstoffe besser kontrolliert wären. Beim Vergleich verschiedener Ablesesysteme wurde zwischen der visuellen Referenzmethode und der vollautomatischen Auswertung eine weitgehende Übereinstimmung der Ergebnisse festgestellt. Nur bei Mannheimia haemolytica kam es zu häufigeren Abweichungen (17,3%) als bei den anderen Bakterienspezies (0-3,4%), da das relativ schwache Wachstum dieses Erregers photometrisch nicht ausreichend erkannt wurde. Für die Bewertung der Ergebnisse von Empfindlichkeitsprüfungen ist das Vorliegen gültiger Grenzwerte Grundvoraussetzung. Nicht für alle Erreger und die vorkommenden Indikationen liegen Daten aus zuverlässigen Quellen vor. Zur Überprüfung des von der AVID 1999 veröffentlichten Grenzwertes von Escherichia coli gegenüber Apramycin wurde die genotypische Resistenz klinischer Isolate von Escherichia coli durch Untersuchung mittels Monoplex-PCR auf Präsenz / Abwesenheit des Gens aac(3’)IV mit dem phänotypischen Merkmal „MHK-Wert“, der mittels Bouillon-Mikrodilution ermittelt wurde, verglichen. Bei 25 Escherichia coli Isolaten mit MHK-Werten £ 16 µg/ml wurde die Abwesenheit des Gens aac(3‘)-IV festgestellt. Bei sechs Isolaten mit MHK-Werten ³ 32 µg/ml wurde die Präsenz des Gens nachgewiesen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den von der AVID festgelegten Grenzwerten für Escherichia coli gegenüber Apramycin: „empfindlich“ bei MHK £ 16 µg/ml und „resistent“ bei MHK ³ 32 µg/ml.