Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Implementierung des Bouillon-Mikrodilutionsverfahrens zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen

Rocksin, Anja

The in-vitro susceptibility testing of bacterial pathogens is crucial for the therapeutic use of antimicrobial agents as well as for a meaningful resistance monitoring. The determination of quantitative data (minimal inhibitory concentrations [MIC values] using the broth microdilution method is considered the method of choice particularly since an internationally accepted guideline (Standard M31-A2 [2002]) has been presented by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, now: Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI); this guideline contains breakpoints for veterinary use and, therefore, allows a classification of bacteria tested based on MIC values. Therefore, the implementation of this technique into routine diagnostics is of high interest particularly for accredited laboratories. For the inoculation of microtiter plates used in the broth microdilution method an inoculation density of 5x105 CFU/ml has to be achieved according to the CLSI standard. A published and commonly used method is the densitiy adjustment of the bacterial suspension using a densitometer. In this study, it was shown that the requested CFU/ml corresponded to the optical density of 0.00027 of a bacterial suspension determined in a spectrophotometer at 625 nm (OD625). The comparison of susceptibility data of clinical isolates determined by agar disk diffusion and, in parallel, by broth microdilution confirmed the comparability of both methods. For most antibiotics the frequency of “very major errors” was below 10%. However, a higher frequency of errors was observed for combinations of antimicrobial agents and bacteria for which no valid breakpoints are available. The comparative testing of cephalothin showed a frequency of “very major errors” of 20.3% for staphylococci and 18.4% for Enterobacteriaceae; for apramycin the frequency of “very major errors” was found to be 46% for Enterobacteriaceae. The comparison of microtitre plates from two manufacturers resulted in differences of two or more titration steps in an average of 5 % of the tests. These differences were generally independent from the density of the inoculum, but they varied with the antimicrobial substances. For 13 substances only minor differences (0 - 4.5%) were observed, whereas for tetracycline, tiamulin and erythromycin differences were 6.8 – 11.4%, and for ampicillin, penicillin and spectinomycin differences were 13.6 – 47.7%. Particularly for the combinations of ampicillin and penicillin with isolates Staphylococcus spp., but also spectinomycin with isolates from Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica a large number of divergent results occurred. For one of the manufacturers, the results of two test series also differed from one another and, most importantly, for spectinomycin the differences in MIC values also resulted in different classifications. The reference strains were used as recommended in the CLSI Standard M31-A2 for quality assurance and proved to be – with a single exception – to be within the accepted MIC ranges. The microtitre plates were coated for diagnostic purposes and, therefore, the concentrations tested for each antimicrobial agent do not allow the determination of unambiguous MIC values for the reference strains used. This, in turn, resulted in deficits in the quality assurance process of the coated plates performed by the manufacturers which became apparent when testing isolates from Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, and Staphylococcus spp. . Therefore, in the future additional reference strains should be included in the quality assurance process. The comparison of two read-out systems, the visual method (accepted as reference method) and the automated spectrophotometrical analysis, showed a good agreement of both methods with most species tested (differences 0-3.4%). Only for Mannheimia haemolytica frequent differences were observed (17.3%); this is most likely due to the relatively weak growth of the organism which is not sufficient for spectrophotometrical detection. The classification of MIC values requires the existence of valid breakpoints. Not for all pathogens and indications such values are available. Therefore, in order to confirm the tentative breakpoints of apramycin for Escherichia coli suggested by the AVID (1999) the specific genotype (presence/absence of the apramycin resistance gene (aac[3’]-IV) was determined in clinical isolates that exhibited different MIC values for apramycin. The observation that 25 Escherichia coli isolates with MIC values of < 16µg/ml did not carry the resistance gene and six isolates with MIC values of > 32 µg/ml carried the resistance gene confirmed the proposed apramycin breakpoints of £ 16 µg/ml for susceptible isolates and ³ 32 µg/ml for resistant isolates.

Die in-vitro Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Infektionserreger ist für den zielgerichteten Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen sowie für ein aussagekräftiges Resistenzmonitoring unerlässlich. Die Ermittlung quantitativer Daten in Form von Minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werten) mittels Bouillon-Mikrodilution wird hierfür als Methode der Wahl angesehen. Mit dem Standard M31-A2 (2002) wurde durch das Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), vormals National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) eine international anerkannte Durchführungsvorschrift vorgelegt, die erstmals veterinärmedizinische Grenzwerte enthält und somit eine Klassifizierung der getesteten Infektionserreger anhand ihrer MHK-Werte erlaubt. Die Implementierung dieses Verfahrens in die Routinediagnostik ist damit insbesondere für akkreditierte Laboratorien von großem Interesse. Bei der Beimpfung der Mikrotiterplatten für das Bouillon-Mikrodilutionsverfahren ist gemäß CLSI Standard eine Einsaatdichte von 5 x105 KBE/ml zu erreichen. Eine beschriebene Methode hierzu ist die Einstellung der Bakteriensuspension mittels Densitometer. In der vorliegenden Studie wurde anhand von Referenz- und Typstämmen durch regressionsanalytische Auswertung der Abhängigkeit zwischen optischen Dichten und Lebendkeimzahlen alternativ dazu ein Wert erarbeitet, mit dessen Hilfe die Einstellung des Inokulums mit einem Photometer möglich ist. Hierfür wird von der Bakteriensuspension eine 1:10 Verdünnung hergestellt und von dieser die optische Dichte bestimmt. Der in dieser Studie ermittelte Wert für die „gewünschte optische Dichte“ beträgt 0,00027. Bei dem Vergleich von Ergebnissen aus Empfindlichkeitsprüfungen klinischer Isolate mittels Agardiffusionsverfahren und paralleler Testung mittels Bouillon-Mikrodilutionsverfahren konnte die Korrelation solcher Werte bestätigt werden. Die Methoden der Empfindlichkeitsprüfungen wurden hierbei gemäß den Vorschriften des CLSI (NCCLS M31-A2 2002) durchgeführt. Bei den meisten antimikrobiellen Wirkstoffen kam es zu Fehlerquoten unter 10% bei den größtmöglichen Fehlern („very major errors“). Bei der Bewertung von Ergebnissen aus Empfindlichkeitsprüfungen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen, für die keine validen Grenzwerte bei der gewählten Indikation zur Verfügung stehen, kam es zu häufigeren Fehlern. Die Untersuchung von Cephalothin ergab gegenüber Staphylokokken in 20,3% und gegenüber Enterobacteriaceae in 18,4% der Fälle „very major errors“. Bei Apramycin kam es gegenüber Enterobacteriaceae bei 46% der Testergebnisse zu „very major errors“. Der Materialvergleich zwischen den Mikrotiterplatten von zwei Herstellerfirmen im Rahmen der vorliegenden Studie ergab Unterschiede in den Ergebnissen der Isolate von durchschnittlich 5%. Die Mikrotiterplatten wurden mit klinischen Isolaten gemäß Herstellervorschriften und den Vorgaben des Standards M31-A2 des CLSI (NCCLS 2002) in verschiedenen Ansätzen untersucht. Die Abweichungen waren im Wesentlichen unabhängig von der Inokulumdichte und sie waren bei den verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen unterschiedlich hoch. Bei 13 Wirkstoffen traten nur geringfügige Abweichungen (0 - 4,5%) auf, bei Tetracyclin, Tiamulin und Erythromycin lagen Abweichungen von 6,8 - 11,4% und bei Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin von 13,6 - 47,7% vor. Bei einigen Erreger-Wirkstoff Kombinationen gab es auffällige Abweichungen, die sich ebenfalls auf die drei Antibiotika Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin konzentrierten. Bei einer der beiden Herstellerfirmen unterschieden sich die Ergebnisse zweier Testansätze auch untereinander. Die Unterschiede in den ermittelten MHK-Werten wirkten sich bei Spectinomycin auch auf die daraus resultierende Einordnung in die qualitativen Kategorien aus. Die im CLSI Standard M31-A2 (NCCLS 2002) zur Qualitätssicherung empfohlenen Referenzstämme wurden bei den Empfindlichkeitsprüfungen mitgeführt. Die ermittelten MHK-Werte lagen dabei bis auf einen Fall in den Referenzbereichen. Da es sich bei den verwendeten Mikrotiterplatten um diagnostische Platten handelt, sind einige MHK-Reihen verkürzt, wodurch nicht alle Referenzstämme in jedem Grenzbereich eindeutige Ergebnisse liefern. Die auffälligen Abweichungen bei Ampicillin, Penicillin und Spectinomycin wurden anhand der Testung klinischer Isolate von Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica und Stapyhlococcus spp. deutlich, während die mitgeführten Referenzstämme noch in den Referenzbereichen lagen. Um die Konzentrationen der Wirkstoffe adäquat zu überprüfen, müssen demzufolge unbedingt mehrere geeignete Referenzstämme zur Qualitätskontrolle mitgeführt werden. Des Weiteren könnte die Qualitätskontrolle mit sensibleren Indikatororganismen sinnvoll ergänzt werden, wodurch auch die Grenzwerte im sensiblen Bereich einiger antimikrobieller Wirkstoffe besser kontrolliert wären. Beim Vergleich verschiedener Ablesesysteme wurde zwischen der visuellen Referenzmethode und der vollautomatischen Auswertung eine weitgehende Übereinstimmung der Ergebnisse festgestellt. Nur bei Mannheimia haemolytica kam es zu häufigeren Abweichungen (17,3%) als bei den anderen Bakterienspezies (0-3,4%), da das relativ schwache Wachstum dieses Erregers photometrisch nicht ausreichend erkannt wurde. Für die Bewertung der Ergebnisse von Empfindlichkeitsprüfungen ist das Vorliegen gültiger Grenzwerte Grundvoraussetzung. Nicht für alle Erreger und die vorkommenden Indikationen liegen Daten aus zuverlässigen Quellen vor. Zur Überprüfung des von der AVID 1999 veröffentlichten Grenzwertes von Escherichia coli gegenüber Apramycin wurde die genotypische Resistenz klinischer Isolate von Escherichia coli durch Untersuchung mittels Monoplex-PCR auf Präsenz / Abwesenheit des Gens aac(3’)IV mit dem phänotypischen Merkmal „MHK-Wert“, der mittels Bouillon-Mikrodilution ermittelt wurde, verglichen. Bei 25 Escherichia coli Isolaten mit MHK-Werten £ 16 µg/ml wurde die Abwesenheit des Gens aac(3‘)-IV festgestellt. Bei sechs Isolaten mit MHK-Werten ³ 32 µg/ml wurde die Präsenz des Gens nachgewiesen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den von der AVID festgelegten Grenzwerten für Escherichia coli gegenüber Apramycin: „empfindlich“ bei MHK £ 16 µg/ml und „resistent“ bei MHK ³ 32 µg/ml.

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Rocksin, Anja: Untersuchungen zur Implementierung des Bouillon-Mikrodilutionsverfahrens zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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