Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modells zur Analyse einzelner disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der humanen Ösophaguskarzinom-Zelllinie PT1590

Rose, Julia

The study was aimed to establish a SCID-mouse-tumor-xenograft-model to analyse single and disseminated tumor cells using the recently established human esophageal carcinoma cell line PT1590. The tumorigenicity and ability to metastasise of this cell line, has already been proved after a subcutaneous injection of these cells in SCID-mice [Scheunemann et al. (1999), N. Engl. J. Med. 340, 1687; Hosch et al. (2000), Cancer Res. 60, 6836-6840].   With the purpose of a better detection and for continuing analyses of PT1590 cells within SCID-mice, the cells were transfected with the gene for the green-fluorescent-protein (GFP). Our study was based on the codon-optimized variant, the so-called enhanced-green-fluorescent-protein (EGFP). This type shows a 5-10 times stronger expression compared to the wildtypus.   The transfection of PT1590-cells was carried out by the application of electroporation and with the lipofection-method, which additionally uses a retroviral vector. In this way, we achieved to generate 10 stable PT1590–EGFP-subclones of which 3 subclones were chosen for subsequent mouse experiments, due to their strong EGFP-expression. A pilot test had shown, that all of these 3 subclones were able to induce local tumors after subcutaneous application.   The main experiment focussed on the PT1590-EGFP-H/4-subclone. Each of in total 60 female SCID-mice got subcutaneous injections of 2x106 PT1590-EGFP-H/4-cells. As soon as the local tumors had reached a size of 15 mm, the mice were sacrificed and subsequently underwent autopsy. The secondary organs (lung, bone marrow, liver, spleen, kidney) were taken out and examined macroscopically in respect of the presence of metastases, as well as microscopically regarding the EGFP-expression of the subcutaneous tumors using an inverted microscope equipped with an epi-fluorescence condensor. After a mechanical disaggregation of the secondary organs by using the Medimachine (DakoCytomation, Hamburg) to bring about single cell suspensions, these were controlled in the inverted microscope for the presence of disseminated tumor cells. In the 60 mice used, the injection of PT1590-cells caused local tumors; additionally, the ability for GFP fluorescence could be demonstrated in all of the subcutaneous tumors found.   Thus, one of the most remarkable results obtained during the course of this study, in comparison with the available literature, was the clear demonstration of disseminated PT1590-cells in all of the examined secondary organs. In summary, the results corroborate the view that a reliable and valid model for a laboratory animal-xenograft system to detect disseminated tumor cells could be established in humans. This model makes it possible to get a better insight into the molecular mechanisms of the process of metastasis.

Das Ziel dieser Studie stellte die Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modells zur Analyse einzelner, disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der erst kürzlich etablierten humanen Ösophagus-Adenokarzinom-Zelllinie PT1590 dar. Die Tumorigenität und Metastasierungsfähigkeit der Zelllinie PT1590 wurde bereits nach subkutaner Applikation in SCID-Mäuse nachgewiesen (Scheunemann et al. (1999), N. Engl. J. Med. 340, 1687; Hosch et al. (2000), Cancer Res. 60, 6836-6840).   Zur besseren Detektion und Durchführung weiterführender Analysen der PT1590-Zellen in der SCID-Maus, erfolgte die Transfektion der Zellen unter Verwendung des Markergens für das green-fluorescent-protein (GFP). Hierfür wurde in dieser Studie die Codon-optimierte Variante, das sogenannte enhanced-green-fluorescent-protein (EGFP) gewählt, welches gegenüber dem Wildtyp eine 5-10fach stärkere Expression aufweist. Die Transfektion der PT1590-Zellen wurde sowohl unter Anwendung der Elektroporation, als auch mit der Lipofektionsmethode, bei der zusätzlich ein retroviraler Vektor eingesetzt wurde, durchgeführt. Hierbei gelang die Generierung 10 stabiler PT1590-EGFP-Subklone, von denen 3 Subklone aufgrund ihrer starken EGFP-Expression für die anschließenden SCID-Mausexperimente ausgewählt wurden. In einem Vorversuch erfolgte die Überprüfung  der Tumorigenität dieser 3 Subklone in SCID-Mäusen. Es zeigte sich, dass alle 3 Subklone nach subkutaner Applikation zur lokalen Tumorbildung befähigt waren.   Für den nachfolgenden Hauptversuch wurde der Subklon PT1590-EGFP-H/4 ausgewählt. Insgesamt 60 weiblichen SCID-Mäusen wurden jeweils 2x106 der PT1590-EGFP-H/4-Zellen subkutan appliziert. Sobald eine lokale Tumorgröße von ³ 15 mm erreicht wurde, erfolgte die Euthanasie mit anschließender Obduktion der Mäuse. Hierbei wurden jeder Maus die Sekundärorgane (Lungen, Knochenmark, Leber, Milz, Nieren) entnommen und diese sowohl auf eine makroskopische Metastasierung hin, als auch die EGFP-Expression dieser subkutanen Tumoren unter dem Invert-Auflicht-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Nach mechanischer Disaggregation der Sekundärorgane unter Einsatz der Medimachine (DakoCytomation, Hamburg) zu Einzellzellsuspensionen, wurden diese unter dem Invert-Auflicht-Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit disseminierter Tumorzellen hin analysiert.            Es ließen sich zum Einen bei allen 60 applizierten Mäusen lokale subkutane Tumoren nachweisen, des Weiteren blieb die Fluoreszenzfähigkeit von PT1590-EGFP-H/4-Zellen in allen subkutanen Tumoren der Mäusen erhalten. Einen deutlichen Erfolg dieser Studie stellt, im Vergleich mit der vorhandenen Literatur, der fluoreszenzmikroskopisch durchgeführte Nachweis disseminierter PT1590-EGFP-H/4-Zellen in allen Sekundärorganen dar.   Insgesamt sprechen diese Ergebnisse für eine erfolgreiche Etablierung eines validen und verläßlichen Kleintier-Xenograft-Modells zur weiterführenden Analyse einzelner humaner, disseminierter Tumorzellen. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchungen molekularer Grundlagen und Mechanismen von Metastasierungsvorgängen.

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Rose, Julia: Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Xenograft-Modells zur Analyse einzelner disseminierter Tumorzellen unter Verwendung der humanen Ösophaguskarzinom-Zelllinie PT1590. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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