Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Opioid receptors in the chicken brain

Sanyathitiseree, Pornchai

The term “opioid” generally refers to any substance, endogenous or synthetic peptide or non-peptide, which acts through any of the four major types of opioid receptors present in the cell membrane. Its effects can be stereospecifically blocked by pure narcotic antagonists like naloxone. The four major classes of endogenous opioid peptides, b-endorphin, enkephalin, dynorphin and nociceptin have been described as potential ligands for the m, d, k and opioid receptor like (ORL1) receptor binding sites. Opioid peptides and their receptors are implicated in the modulation of a number of behavioral and physiological functions in birds (e.g., reproduction, endocrinology, water balance, social behavior and painful stimulus) in a manner similar to that described for mammals. Opioids are (neuro) peptides, which are synthesized in the central nervous system (CNS) in the whole animal kingdom. They play a role both as neurotransmitters and neuromodulators.Opioid peptides and their receptors are implicated in the modulation of a number of behavioral and physiological functions in birds (e.g., reproduction, endocrinology, water balance, social behavior and painful stimulus) in a manner similar to that described for mammals. Nowadays, more attention is being paid to the effect of the opioid system on the water balance in birds. Opioid drugs were also introduced in veterinary medicine for pain relieving and anesthesia of birds. The studies reported in this dissertation were undertaken to further elucidate opioid receptors, the physiological intervention on receptor binding properties and their regulation. To this end, we evaluated the receptor binding profiles - the dissociation constant (Kd) and maximum binding capacity (Bmax) - in various brain regions. Following questions were addressed using the chicken as model. Are opioid binding profiles gender-, and/or age-dependent in the chicken brain? Are opioid binding profiles affected by dehydration in the chicken brain? Are opioid binding profiles testosterone-dependent?, and Are opioid binding profiles affected by opioid antagonist? To achieve this, the opioid binding sites were determined in six brain regions - frontal cortex, lateral septum, striatum, amygdala, hippocampus and hypothalamus - of chicken using [3H]diprenorphine ([3H]DPN) as the radioligand. Three age groups of chickens, 10-day-, 10-week- and 26-38-week-old, were used. Following situations were considered (a) the effects of hydration (b) the effect of testosterone treatments (performed in castrated male chickens) and (c) the effect of opioid antagonist, naltrexone. Experiment I, opioid binding sites were investigated in 10-day-, 10-week- and 26-38-week-old female and male chickens. The linear Scatchard plot of [3H]DPN binding in all experiments indicated a single binding site with high affinity. The mean of Bmax was as following: 0.27-0.44 (female), 0.23-0.33 (male); 0.21-0.48 (female), 0.21-0.41 (male); 0.19-0.34 (female), 0.17-0.34 (male) pmol/mg in 10-day-, 10-week- and 26-38-week-old chickens, respectively. The mean of Kd was as follow:  1.13-1.80 (female), 0.72-1.01 (male); 0.28-0.48 (female), 0.27-0.83 (male); 0.33-0.75 (female), 0.26-0.58 (male) nM in 10-day-, 10-week- and 26-38-week-old chickens, respectively. The highest concentration of opioid binding sites was found in the frontal cortex and the lowest concentration in the hypothalamus both in males and females. The Bmax of opioid binding sites decreased significantly from 10-day-old to adulthood in the frontal cortex, striatum and amygdala regions. While there was no such a decrease in males. The data also indicated that the sex related change in opioid binding reflects a change in the Kd in males more than in females. Experiment II, groups of 10-day-, 10-week- and 26-38-week-old chickens were deprived from water for 1 or 2 days. Dehydration induced an increase of plasma AVT levels and had some impacts on the characteristics of opioid binding sites in the brain.  Most of the changes of opioid binding site were in young female chickens. The results also indicated that dehydration induced both decrease (frontal cortex, striatum and amygdala: 10-day-old females; lateral septum: adult females; and hypothalamus: 10-day-old males) and increase (lateral septum, hippocampus and hypothalamus: 10-week-old females) of Bmax in chicken brains. Such changes were accompanied with alterations in receptor affinity. Experiment III, male chickens were castrated and sham-operated for 7 months and were treated with testosterone proprionate or testosterone proprionate and naltrexone. The Bmax value in the brain of castrated chickens was higher than that found in intact animals. This increase was testosterone-dependent, since testosterone substitution reduced the binding capacity to the control levels. The extent of opioid binding site changes after naltrexone administration was more pronounced in the Kd than in the Bmax values. The regional differences in naltrexone-induce changes imply that the drug does not have uniform effects throughout the brain. The Bmax was significantly increased in the hypothalamus only. In conclusion, these results demonstrate, that like in some mammals, opioid binding sites are involved in modulation of water balance and reproduction in chickens. Such modulations are age-, sex- and brain region dependent.

Der Begriff “Opioide” bezeichnet allgemein alle körpereigenen oder synthetischen, Peptide oder Nichtpeptidstruktur, die durch eine Bindung an einem der vier Haupttypen der Opioidrezeptoren wirken. Der Begriff “Opiat” bezeichnet Verbindungen mit biologische Eigenschaften, die dem des Morphin entsprechen (Nichtpeptidstruktur). Der alte Begriff “Opiate” ist jetzt durch den Begriff Opioide ersetzt worden. Der Begriff “endogene Opioide” bezieht sich auf körpereigene Substanzen, die im Gehirn oder in anderen Organen vorkommen. Diese Opioide haben pharmakologische Eigenschaften, die denen des Opiatabkömmlings Morphin ähneln, und gehen natürliche Bindungen mit den Opioidrezeptoren ein. Die körpereigenen Opioide sind überwiegend Peptide, obwohl auch solche mit Nichtpeptidstruktur beschrieben sind. Abweichend von den Opiaten werden die Opioide mit Peptidstruktur schnell nach ihrer Freisetzung abgebaut und akkumulieren nicht in Mengen, die groß genug sind um, eine Toleranz auszulösen. Die vier Hauptklassen körpereigener Opioide sind Endorphin, Enkephalin, Dynorphin und Nociceptin. Sie sind Liganden für die m-, d-, k- beziehungweise ORL-1 (Opioid Receptor like) - Bindungsstellen.             Opioide sind (Neuro-) Peptide, die im Zentralnervensystem (ZNS) synthetisiert oder und im gesamten Tierreich vorkommen. Sie spielen sowohl als Neurotransmitter als auch als Neuromodulatoren eine Rolle. Opioide sind an der Modulation einer Reihe physiologischer Funktionen bei Vögeln beteiligt (z.B. Fortpflanzung, Endokrinologie, Wasserhaushalt, Sozialverhalten). Derzeit wird dem Einfluss des Opioid-Systems auf den Wasserhaushalt bei Vögeln vermehrt Aufmerksamkeit geschenkt. Ausserdem wurden Opioid-Pharmaka in der Veterinärmedizin eingesetzt zur Anästhesie und zur Schmerzlinderung bei Vögeln. Die in dieser Dissertation dargestellten Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Opioidrezeptoren, die physiologische Beeinflussung der Rezeptorbindungseigenschaften und deren Regulation näher aufzuklären. Zu diesem Zweck wurden die Rezeptorbindungsprofile- bestimmt als Dissoziationskonstante (Kd) und maximale Bindungskapazität (Bmax)-in verschiedenen Gehirnabschnitten des Huhnes als Modell benutzt.             Die Fragestellungen waren im einzelnen:             1. Sind die  Opioidbindungsprofile im Hühnergehirn geschlechts- und/oder altersabhängig?             2. Werden die  Opioidbindungsprofile durch Wasserentzug beeinflusst?             3. Sind die  Opioidbindungsprofile testosteronabhängig?             4. Werden die  Opioidbindungsprofile durch Opioidantagonisten beeinflusst?             Opioidbindungsstellen wurden in sechs Gehirnregionen – Frontaler Cortex, Laterales Septum, Striatum, Amygdala, Hippocampus und Hypothalamus untersucht. Als Ligand wurde [3H]Diprenorphin ([3H]DPN) eingesetzt. Es wurden drei Altersgruppen von Küken untersucht: 10 Tage-alt, 10 Wochen-alt und 26 bis 38 Wochen-alt. Folgende Aspekte wurden untersucht: a) der Einfluss von Wasserentzug, b) der Einfluss von Kastration und Testosteronsubstitution, und c) der Einfluss des Opioidantagonisten Naltrexon. Experiment I: Opioidbindungsstellen wurden bei 10 Tage-, 10 Wochen- und 26 bis 38 Wochen-alten weiblichen und männlichen Küken untersucht. In allen Versuchen war der Scatchard plot der [3H]DPN-Bindungen linear und wies auf eine Bindungsstelle mit hoher Affinität hin. Sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Tieren wurden die höchste Konzentrationen von Opioidbindungsstellen im Frontalen Cortex ermittelt. Die niedrigsten Werte wurden im Hypothalamus gemessen. Eine signifikante Abnahme der Bmax war in der Amygdala, im Striatum und im Frontalen Cortex mit steigendem Alter (Tag 10 bis erwachsenem Alter) bei Hennen zu beobachten. Keine altersbedingte Veränderung der Dichte der Opioidbindungsstellen war bei männlichen Tieren nachweisbar. Diese Geschlechtsdifferenzierung war zum Teil auch bei Kd-Werten vorhanden. Die Mittelwerte der maximalen Bindungskapazität betrugen bei am Tag 10: 0,27-0,44 (weiblich), 0,23-0,33 (männlich); bei 10 Wochen alten Tieren: 0,21-0,48 (weiblich), 0,21-0,41 (männlich); bei erwachenen Tieren: 0,19-0,34 (weiblich), 0,17-0,34 (männlich) pmol/mg. Die Mittelwerte der ermittelten Dissoziationskonstante betrugen bei am Tag 10: 1,13-1,80 (weiblich), 0,72-1,01 (männlich); bei 10 Wochen alten Tieren: 0,28-0,48 (weiblich), 0.27-0.83 (männlich); bei erwachenen Tieren: 0,33-0,75 (weiblich), 0,26-0,58 (männlich) nM. Die gemessenen Bmax-Werte der Opioidbindungsstellen im Frontalen Cortex, Striatum und Amygdala fielen vom 10-Tage-alten Küken bis zur erwachsenen Henne signifikant ab, während solcher Abfall bei den männlichen Tieren nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse weisen außerdem darauf hin, dass die geschlechtsgebundene Veränderung der Opioidbindungen eine Veränderung des Kd – Wertes bei männlichen Tieren stärker als bei weiblichen widerspiegelt. Experiment II: Küken wurden in verschiedenen Altersgruppen einem eintägigen (10-Tage-alte) oder zweitägigen (10-Wochen-alte und adulte Tiere) Wasserentzug ausgesetzt. Diese Dehydration bewirkte einen Anstieg des AVT-Plasmawerte. Darüber hinaus verursachte der Wasserentzug Veränderungen der Konzentration von Opioidbindungsstellen in den untersuchten Gehirngebieten.  Die stärksten Veränderungen der Opioidbindungsstellen wurden bei 10 Tagealten und 10 Wochenalten weiblichen Hühnen gefunden. Die Ergebnisse liessen außerdem erkennen, dass der Wasserentzug einen Bmax Abfall (Frontaler Cortex, Striatum und Amygdala: 10-Tagealten weiblich; Laterales Septum: 26 bis 38 Wochenalten weiblich; und Hypothalamus: 10-Tagenalten männlich) oder Anstieg (Laterales Septum, Hippocampus und Hypothalamus: 10-Wochenalten weiblich) im Gehirn der Tiere bewirkte. Diese Veränderungen wurden von einem Anstieg oder Abfall der Bindungsaffinität begleitet. Experiment III: Männliche Küken wurden in Alter von 3-4 Wochen kastriert und schein-operiert.  7 Monate nach der Kastration wurden die Tiere in drei Gruppen geteilt. Gruppe 1 diente als unbehandelte Kontrollgruppe. Gruppe 2 erhielt über einen 10 Tage-Zeitraum im Abstand von jeweils 3 Tagen intramuskuläre Injektionen von Testosteronproprionat (TP, 10mg/kg ) Gruppe 3 erhielt die gleiche Testosteronbehandlung wie Gruppe 2 und wurde zusätzlich zu TP auch mit Naltrexon behandelt (0,1mg/kg); von Tag 3 nach Beginn der Testosteroninjektionen für 7 Tage im 8 Stunden-Intervall. Die Kastration bewirkte eine signifikante Zunahme der Opioidbindungsstellen im Gehirn. Diese Zunahme war testosteronabhängig, da sie durch eine Testosteronsubstitution reversibel war. Die Veränderungen bei den Rezeptorbindungsprofilen waren bei den Kd–Werten ausgeprägter als bei den Bmax–Werten. Die festgestellten Unterschiede der Veränderungen in den untersuchten Gehirnregionen nach Applikation des Präparates Naltrexon zeigten, dass dieser Opioidantagonist nicht einheitlich im gesamten Gehirn wirkt. Nach der Applikation von Naltrexon zeigten die Bmax–Werte nur im Hypothalamus einen signifikanten Anstieg. Die Schlussfolgerungen aus den vorstehend dargestellten Untersuchungen lassen sich wie folgt zusammenfassen: a) Ebenso wie bei einigen Säugetierspezies sind auch bei Hühnern die Opioidbindungsstellen an der Regulation des Wasserhaushaltes und der Fortpflanzung modulierend beteiligt. b) Die einhergehenden Veränderungen die Rezepterbindungsprofile ist abhängig vom Alter und vom Geschlecht der Tiere. Außerdem sind in den untersuchten Gehirnregionen unterschiedliche Veränderung auf die osmotische Stimulation zu finden.

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Sanyathitiseree, Pornchai: Opioid receptors in the chicken brain. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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