Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Magermilch auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Blutleukozyten

Sulzer, Astrid

This study’s focus was to analyse, under standardised in vitro conditions, the in vivo changes in blood leukocytes that reached the milk compartment, and to interpret them in relation to the cellular defence system of the bovine udder.   The question of whether immunological or bacteriological-induced mediators exert an influence on bovine blood leukocytes was intended to be answered by incubating these cells in skimmed milk of different cows. Cytobacteriological results and data regarding the lactation physiology were also included in the analysis.   The literature consulted shows that immune cells suffer changes in their functionality regarding capacity for phagocytosis, generation of reactive oxygen species (ROS) and ability for proliferation once they abandon the blood vessels and enter lactiferous compartments of the udder. However, little is known on the influence of milk of the phenotype. In milk, these leukocytes are confronted, at a low pH, with high concentrations of fat, protein, lactose and minerals and with immunological-active components such as antibodies, cytokines, factors of complement and prostaglandins. These constituents do have an influence on the functional properties of immune cells, e.g. polymorphonuclear leukocytes (PMN) might degranulate or phagocyte milk constituents loosing their potential of blocking microorganisms.   Both phenotypic (surface antigens) and functional parameters such as capacity for phagocytosis and formation of reactive oxygen complexes of blood PMN after incubation in skimmed milk were determined in the present work. Methods designed so far only for the direct measurement of blood and milk PMN were adapted to the incubation of cells in skimmed milk and then, milk samples from udder quarters with different health status were analysed.   The expression of the surface antigens CD11b, Bo116, Bo139, CD4 and CD8 was not affected by the incubation of blood leukocytes in skimmed milk. Therefore, the differences in the expression density between blood an milk PMN as described by various authors may not be deduced entirely by the residence of the cells in the medium milk, but are probably also due to the passage via the blood-milk barrier.   Chemiluminescence (CL) of blood PMN was reduced by adding skim milk to the nutritive medium. However, the results of the methodological experiments showed that this reduction was partially due to the opacity of the skimmed milk. Because of its time-dependence, this method should not be applied when measuring a major amount of samples.   All other parameters (expression density of the surface structure identified by IL-A110, capacity to phagocytosis, ROS) displayed higher values after the incubation of blood PMN in skimmed milk than after the incubation in the nutritive medium. These parameters also showed higher values when incubated in skim milk of diseased quarters than when skimmed milk of healthy quarters was used for incubation. Likewise, strippings with a physiologically-elevated cell count lead to a higher relative CL and relative expression density of IL-A110.   Thus, the environment provided by skimmed milk does not imply a reduced functional capacity of milk PMN when compared to blood PMN; contrarily, activation takes place. Yet, regarding capacity for phagocytosis, it is well-known that it is affected mainly by the phagocytosis of milk fat. Both increases in capacity for phagocytosis and generation of reactive oxygen species may be reversed by washing the cells after their incubation in skim milk, meaning that the direct presence of milk is not mandatory in this case.   The reasons for why the measurement of the respiratory burst with two different methods yielded markedly distinctive results eluded their conclusive explanation. Still, the determination of CL with a luminometer experiences impairment by the inherent opacity of skim milk.   By means of a weekly progressive survey of 20 cows during their first 10 weeks of lactation it could be shown that the relative expression density of the surface structure identified by IL-A110 is increased in skim milk of mastitic udder quarters, decreasing again with healing. In skim milk from udder-healthy quarters however, a decrease followed by an increase towards the end of the early lactation was observed for both parameters.   The results of this study prove that skim milk is capable of modulating the immuno-phenotypic and functional parameters of bovine PMN. These changes are triggered by means of the direct contact of skim milk with PMN. Given the enormous array of immunomodulating constituents in skim milk (mediators, opsonins, casein, lactoferrin) it was not possible to determine the exact substances responsible for this immunomodulation.

Ziel dieser Untersuchungen war es, in vivo ablaufende Veränderungen von Blutleukozyten, die das Kompartiment der Milch erreicht haben, unter standardisierten in vitro Bedingungen zu analysieren und im Hinblick auf das zelluläre Abwehrsystem der bovinen Milchdrüse zu interpretieren.   Durch die Inkubation boviner Blutleukozyten in Magermilch unterschiedlicher Kühe sollte untersucht werden, inwieweit Mediatoren immunologischen bzw. bakteriologischen Ursprungs diese Zellen beeinflussen. In die Analyse wurden auch zytobakteriologische Ergebnisse der Milchprobe und laktationsphysiologische Gesichtspunkte einbezogen.   Literaturangaben belegen, dass Abwehrzellen des Blutes, wenn sie in die milchführenden Bereiche des Euters gelangen, eine Funktionalitätsänderung hinsichtlich der Phagozytosekapazität, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und Fähigkeit zur Proliferation erfahren. Über den Einfluss von Milch auf den Phänotyp ist wenig bekannt. In der Milch treffen diese Leukozyten bei einem niedrigen pH- Wert auf hohe Konzentrationen an Fett, Protein, Laktose und Mineralstoffen und auf immunologisch wirksame Bestandteile wie Antikörper, Zytokine, Komplementfaktoren und Prostaglandine. Diese Milchinhaltsstoffe haben einen Einfluss auf die funktionellen Eigenschaften der Abwehrzellen. PMN z.B. können degranulieren oder Milchbestandteile phagozytieren und dadurch das Potential zur Abwehr von Mikroorganismen verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl phänotypische Parameter (Oberflächenantigene), als auch funktionelle Parameter wie Phagozytosekapazität und Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen von Blut-PMN nach Inkubation in Magermilch bestimmt. Die bislang nur für die direkte Messung auf Blut- und Milch-PMN vorliegenden Methoden wurden an die Inkubation der Zellen in Magermilch angepasst und anschließend Magermilchproben aus Eutervierteln mit unterschiedlichem Gesundheitsstatus untersucht. Die Expression der Oberflächenantigene CD11b, Bo116, Bo139, CD4 und CD8 wurde durch die Inkubation von Blutleukozyten in Magermilch nicht beeinträchtigt. Die von verschiedenen Autoren beschriebenen Unterschiede in der Expressionsdichte zwischen Blut- und Milch-PMN lassen sich somit nicht allein auf einen Aufenthalt der Zellen im Medium der Milch zurückführen, sondern werden wahrscheinlich auch durch die Passage der Blut-Euter-Schranke bedingt.   Die CL von Blut-PMN wurde durch Zugabe von Magermilch zum Nährmedium reduziert. Ergebnisse der methodischen Versuche belegen jedoch, dass diese Reduktion z.T. auf die Trübung der Magermilch zurückzuführen ist. Aufgrund der Zeitabhängigkeit der CL kann diese Methode nicht zur Untersuchung einer größeren Anzahl an Stichproben genutzt werden.   Alle anderen untersuchten Messkriterien (Expressionsdichte der von IL-A110 erkannten Oberflächenstruktur, Phagozytosekapazität, ROS) wiesen nach der Inkubation der Blut-PMN in Magermilch höhere Werte auf als nach der Inkubation im Nährmedium. Für diese Parameter konnten nach Inkubation in der Magermilch von erkrankten Eutervierteln höhere Werte nachgewiesen werden als nach Inkubation in Magermilch aus gesunden Vierteln. Auch Nachgemelke mit physiologisch erhöhtem Zellgehalt führten zu einer höheren relativen CL und relativen Expressionsdichte von IL-A110.   Die Umgebung der Magermilch alleine führt also nicht zur reduzierten funktionellen Kapazität der Milch-PMN gegenüber Blut-PMN, es findet im Gegenteil eine Aktivierung statt. Für die Phagozytosekapazität allerdings ist bekannt, dass sie hauptsächlich durch die Phagozytose von Milchfett beeinträchtigt wird. Die Erhöhung der Phagozytosekapazität und der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies kann durch Waschen der Zellen nach Inkubation in Magermilch rückgängig gemacht werden, die direkte Anwesenheit von Milch ist hier also nötig.   Nicht abschließend geklärt werden konnte, warum die Messung des Respiratory burst mit zwei verschiedene Methoden zu deutlich differierenden Ergebnissen führt. Die Messung der CL im Luminometer wird jedoch durch die Trübung der Magermilch beeinträchtigt.   In einer wöchentlichen Verlaufsuntersuchung von 20 Kühen über die ersten 10 Laktationswochen konnte nachgewiesen werden, dass die relative Expressionsdichte der von IL-A110 erkannten Oberflächenstruktur auf PMN in der Magermilch von mastitiskranken Eutervierteln erhöht war und mit der Heilung der Erkrankung wieder abnahm. In Magermilch aus gesunden Eutervierteln wurde im Verlauf der Frühlaktation für beide Parameter zunächst ein Abfall und gegen Ende der Frühlaktation ein Anstieg beobachtet.   Die Resultate dieser Arbeit belegen, dass Magermilch immunphänotypische und funktionelle Parameter boviner PMN modulieren kann. Ausgelöst werden die Veränderungen durch direkten Kontakt der Magermilch mit den PMN. Aufgrund der Vielfalt der immunmodulierenden Inhaltsstoffe in Magermilch (Mediatoren, Opsonine, Casein, Laktoferrin) konnte nicht ermittelt werden, welche Bestandteile diese Immunmodulation verursachen.

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Sulzer, Astrid: Einfluss von Magermilch auf phänotypische und funktionelle Eigenschaften boviner Blutleukozyten. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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