Anionensekretion im Dünndarm von NKCC1 und CFTR Knockout-Mäusen und ihren gesunden Geschwistern

Weinhold, Cornelia

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Anionensekretion im Dünndarm von NKCC1 und CFTR Knockout-Mäusen und ihren gesunden Geschwistern

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Ziel der vorliegenden Untersuchungen war in erster Linie, die Existenz zellulärer Cl-Aufnahmemechanismen im Jejunum zu klären, welche - alternativ zum Na+/K+/2Cl--Kotransporter - zur Cl--Versorgung der Darmepithelzelle beitragen können. Zu diesem Zweck wurde proximales Jejunum von Na+/K+/2Cl- Knockout-Mäusen und ihren normalen Geschwistern von Serosa- und Muskelschichten befreit und in einen Ussingkammer-Aufbau verbracht. Unter Einsatz geeigneter stimulatorischer und inhibitorischer Substanzen wurden der Kurzschlussstrom (Isc), der Gewebewiderstand (R) und die transepitheliale Potentialdifferenz (PDt) gemessen und simultan die Bikarbonatsekretion (HCO3-) mittels pH-stat-Titration bestimmt. Hierbei sollte ermittelt werden, welche am basolateralen Zellpol lokalisierten Transportproteine unter stimulierten Bedingungen für die Chlorid- und Bikarbonatsekretion eine Rolle spielen und in welcher funktionellen Beziehung sie zueinander stehen. Die nacheinander erfolgende Blockade aller in Frage kommenden alternativen Ionentransportmechanismen ergab, dass sowohl bei NKCC1 (-/-) als auch (+/+) Mäusen der Cl-/HCO3--Austauscher zur Cl--Versorgung des Enterozyten beiträgt. Dabei lassen die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Versuchsergebnisse darauf schließen, dass während der cAMP-stimulierten Anionensekretion bei den normalen Mäusen gleichzeitig eine sowohl von der Aktivität des Na+/HCO3--Kotransporters als auch von der Tätigkeit der Karboanhydrase abhängige HCO3--Versorgung des basolateralen Cl-/HCO3--Austausches stattfindet. Im Falle der NKCC1 (-/-) Mäusen hingegen scheint die Funktion der Karboanhydrase zur Bikarbonatbereitstellung für den Cl-/HCO3--Austauscher von größerer Bedeutung zu sein als die Aktivität des Na+/HCO3--Kotransporters. Aufgrund des ungewöhnlich hohen Isc, welcher nach Blockade aller in Frage kommenden basolateralen Ionenimportmechanismen bei den NKCC1 Knockout-Mäusen verblieb, ist die Möglichkeit nicht auszuschließen, dass weitere noch unbekannte Wege für eine basolaterale Cl--Aufnahme existieren. Dabei kann eine inkomplette Hemmung des Na+/HCO3-Kotransporters durch S0859 nicht ausgeschlossen werden. Als Nächstes galt es zu klären, ob die trotz des nicht vorhandenen Na+/K+/2Cl--Kotransporters hohe Anionenrestsekretion im Dünndarm der NKCC1 Knockout-Mäuse durch eine anstelle des Cl- vermehrte HCO3--Sekretion kompensiert wird. Um dies herauszufinden, wurden Chlorid-Fluxe in sero-mukosaler Richtung durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine basale Chloridsekretion von derselben Höhe wie bei den normalen Mäusen vorhanden ist, welche sich, analog zu den Isc-Ergebnissen, cAMP-abhängig steigern lässt. Daher lässt sich diese Hypothese ausschließen. Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit befasste sich mit der Untersuchung, ob im Dünndarmepithel von cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Knockout-Mäusen als Kompensation für eine mangelhafte Darmsekretion Ionen vermehrt über den parazellulären Weg in das Darmlumen transportiert werden. Dafür wurden Mannit-Fluxe mit und ohne Stimulation in beide Richtungen durchgeführt. Bei beiden Mäusegruppen war jeweils eine Nettoresorption erkennen, die sich bei den CFTR (+/+) Mäusen nach erfolgter Stimulation als etwas höher darstellte. Daraus war abzuleiten, dass die Jejuna der CFTR (-/-) Mäuse im unstimulierten Zustand keine erhöhte parazelluläre Permeabilität aufweisen, welche sich auch nach cAMP-induzierter Stimulation nicht steigern lässt. Bei den normalen Mäusen hingegen bewirkt db-cAMP eine Steigerung der Permeabiliät für größere ungeladene Moleküle vom Darmlumen in die serosale Richtung. Um zu klären, ob diese Erkenntnis auch für kleine geladene Ionen zutrifft, wurden Cl--Fluxe in beide Richtungen durchgeführt. Dies ergab bei den CFTR (-/-) Mäusen nach Stimulation mit db-cAMP eine geringfügige Steigerung des Fluxes in die sero-mukosale Richtung. Demnach weisen die Jejunalepithelien von CFTR (-/-) Mäusen, analog zu den Mannit-Fluxergebnissen, auf cAMP-abhängige Stimulation keine erhöhte parazelluläre Permeabilität für Cl--Ionen auf.

The main purpose of this study was to investigate potential alternative cellular Cl- uptake pathways in the small intestine, which are able (in addition to the well known Na+/K+/2Cl--cotransporter) to support the enterocytes with chloride. To test this hypothesis, serosa- and muscle-stripped jejunal tissues of Na+/K+/2Cl- knockout mice and their normal littermates were mounted in a conventional ussing chamber set-up. Using suitable stimulators and inhibitors, short-circuit-currents (Isc), tissue resistances (R) and potential differences (PDt) were measured simultaneously to the bicarbonate secretion (HCO3-) by pH-stat titration. Thus, it should be found out, which basolateral localized transport proteins may play a key role for the Cl- and HCO3--secretion, when anion secretion is stimulated with cAMP and which functional interaction between both mechanisms could exist. The subsequent inhibition of all known alternative mechanisms of ion transport showed, that in jejuna of both NKCC (-/-) and controls Cl-/HCO3--exchange supports to the overall Cl- secretion of the mucosa. From this it can be assumed, that during cAMP-mediated anion secretion in the normal jejuna the Cl-/HCO3- is supplied with HCO3- by concomitant activity of the Na+/HCO3- cotransporter and the carboanhydrase activity. In NKCC (-/-) also both pathways exist but CO2 hydration by the carboanhydrase is the predominant HCO3- source. Due to the unexpected magnitude of the Isc, when all known basolateral ion transporters in NKCC (-/-) jejuna were blocked, novel basolateral Cl- entry pathways cannot be ruled out. However, it has to be kept in mind that a maximal block of the Na+/HCO3- cotransport by S0859 still has to be proven. Next series of experiments were addressed to the relatively high remaining anion secretion - despite the absence of the Na+/K+/2Cl--cotransporter - present in the NKCC1 (-/-) jejunum, assuming a substitution of HCO3- for Cl- in the secretory fluid. To test this assumption, serosal to mucosal Cl- fluxes were measured, resulting in a basal Cl- secretion of the same magnitude in (-/-) jejunum compared to (+/+). As already seen with Isc this could also be stimulated via the cAMP pathway. Therefore, the latter assumption can be excluded. An other aim of this study was to detect a compensational mechanism for a deficient anion secretion in the small intestine of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator knockout mice, assuming an increased paracellular transport of ions from mucosa to serosal side. For this purpose mannitol flux rates under basal and stimulated conditions were examined. Under both conditions Cl- net resorption occurred, which was higher in the (+/+) jejunum if stimulated. These data suggest that in the CFTR (-/-) jejunum there is un increased paracellular permeability neither under basal conditions nor after stimulation . In contrast, the CFTR (+/+) mice showed after db-cAMP stimulation an increased permeability for mannitol in serosa-to-mucosa direction. To find out, whether this result was also valid for small ions, Cl- fluxes were measured. After stimulation CFTR (-/-) jejuna showed only a very small serosal-to-mucosal increase of Cl- flux. From this it appears rather unlikely that there is an cAMP-induced increase of paracellular permeability for Cl- ions in CFTR (-/-) small intestine as seen with mannitol.