Analysis of the protein kinase p90rsk during in vitro and in vivo maturation of porcine oocytes and its dependence on the mitogen-activated protein kinase (MAPK)

Ziel dieser Untersuchung war es die Kinetik der p90rsk während der in vitro Reifung porziner Eizellen näher zu charakterisieren, eine gegenseitige Abhängigkeit mit der MAPK zu klären und die in vitro erhaltenen Ergebnisse mit den Abläufen während der in vivo Reifung der Eizellen zu vergleichen.   Der Gesamterfolg der IVP von Embryonen ist immer noch unbefriedigend, insbesondere beim Schwein. Als einer der Gründe hierfür gilt die unzureichende Zusammensetzung der Kulturmedien. Um die In-vitro-Kulturbedingungen verbessern zu können, ist es notwendig die molekularen Vorgänge während der Eizellreifung aufzuklären. Die p90rsk und die MAPK sind zwei der wichtigsten Proteinkinasen, die an dem Signaltransduktionsweg beteiligt sind, der zur Wiederaufnahme der Meiose nach ihrer ersten Arretierung führt. Die Aktivierung dieser beiden Kinase erfolgt durch ihre Phosphorylierung, wobei die p90rsk in vitro und vermutlich auch in vivo durch die MAPK phosphoryliert wird.   Kumulus-Oozyten-Komplexe wurden von Schlachttieren gewonnen und in vitro mit und ohne Zusatz des MEK-spezifischen Hemmstoffes U0126 gereift (0, 22, 26, 30, 34, 46 h). Für die In-vivo-Reifung wurden Jungsauen mit eCG (600-800 I.E.) stimuliert. 72 h später wurde die Reifung mit hCG (500 I.E.) induziert. Die Eizellen wurden chirurgisch gewonnen (0, 22, 30 h). Die Proben wurden mittels Elektrophorese und Immunoblot analysiert. Zur anschließenden Darstellung wurde ein verstärkte Chemilumineszenz eingesetzt. Die in vitro gereiften Eizellen wurden weiterhin mittels eines radioaktiven Kinase-Assays untersucht, um die spezifische Kinaseaktivität festzustellen.   Für die In-vitro-Reifung konnte gezeigt werden, dass die p90rsk in porzinen Kumuluszellen, sowie in den Eizellen existiert, und dass sie während des Reifungsprozesses phosphoryliert wird. Durch die Untersuchung mittels Immunoblot konnten zwei Banden der p90rsk mit hoher Mobilität vor dem GVBD dargestellt werden. Das bedeutet, dass die p90rsk bereits in den Eizellen direkt nach der Isolierung aus dem Follikel (0 h) teilphosphoryliert vorliegt. Die Banden mit der geringsten Mobilität gleichbedeutend mit der vollständigen Phosphorylierung des Moleküls, waren erst um den Zeitpunkt des GVBD vorhanden und blieben bis zum Endpunkt der Reifung bestehen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung der p90rsk zeitlich mit der Phosphorylierung der MAPK zusammenfällt. Diese Ergebnisse wiesen auf eine MAPK-abhängige Phosphorylierung der p90rsk hin. Dieser Hinweis wurde durch die Ergebnisse einer Reifung mit Zusatz des Hemmstoffes U0126 zum Maturationsmedium bestätigt. Unter diesen Bedingungen wurde der GVBD vollständig verhindert, ebenso wie eine Phosphorylierung der MAPK und der p90rsk. Der Kinase Assay Kit der zur Untersuchung der spezifischen Kinaseaktivität verwendet wurde, ließ ein Aktivitätsmuster erkennen, das dem der p70S6K in Xenopus- und Mauseizellen ähnelt. Daraus wurde geschlossen, das sich dieser Kit nicht zur Untersuchung der spezifischen Aktivität der p90rsk eignet. Die Ergebnisse der Untersuchung der in vivo gereiften Eizellen zeigten ebenfalls eine Teilphosphorylierung nach 0 h und eine zunehmende Phosphorylierung nach 22 h. Wie erwartet war die Phosphorylierung bei den in vitro gereiften Eizellen bei etwa 90 kDa zu sehen, bei den in vivo gereiften Eizellen hingegen etwas unterhalb von 200 kDa. Es handelt sich vermutlich um einen Molekülkomplex, von dem gezeigt werden konnte, das die MAPK nicht beteiligt ist. Daher liegt das p90rsk Molekül in vivo als Dimer vor. Es wurde geschlussfolgert, dass ausgewachsene porzine Eizellen eine bereits teilphosphorylierte p90rsk im GV Stadium enthalten. Eine weitere Phosphorylierung des Moleküls erfolgt zwischen 22 und 24 h nach Beginn der Kultivierung bzw. Start der In-vivo-Reifung.