Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines funktionellen in vitro Test (FIT) zur Prüfung der Sensibilisierung feliner basophiler Granulozyten von Katzen mit kontrollierter Flohexposition (Ctenocephalides felis felis)

Stuke, Kristin

Flea bite hypersensitivity (flea allergy dermatitis) is one of the most common dermatological disorders in cats. The diagnosis is based on the patient’s medical history and clinical syndromes. The differential diagnosis for flea bite hypersensitivity needs to be excluded. For immunological confirmation of clinical evidences and for identification of the relevant allergen in vitro and in vivo allergy tests are available. However, these tests have shown poor correlations with the clinical presentation. The need to provide evidence of immune mechanisms that are informative for a type I allergy has prompted researchers in the Immunology Unit of the University of Veterinary Medicine Hannover to develop a functional in vitro test (FIT) for diagnosis of type I allergy in horses. With the FIT, allergen-specific antibodies that were bound to basophilic granulocytes in vivo can be determined. This permits discrimination between sensitized and non-sensitized animals. Sensitization can be quantified and evaluated by the amount of histamine released after basophils were stimulated with selected allergens (specific sensitization). Parallel treatments supply information about the total cellular histamine content, the spontaneous histamine release and the general ability of basophils to degranulate after cross-linking of membrane bound antibodies (general sensitization). The aim of this project was to use the FIT to study the histamine release of feline basophilic granulocytes to determine if they provide a suitable tool for in vitro diagnosis of flea bite hypersensitivity. (I) First the FIT should be adapted for the cat by using washed feline blood cells. (II) An attempt should be made to enrich basophils for more sensitive detection of basophil sensitization in the FIT and enriched basophils and those in washed blood should be compared by the FIT. (III) The influence of repeated, controlled flea-exposure on the functional degree of basophil sensitization should be tested in the FIT to investigate if feline basophils may serve as an indicator for a C. felis-specific type I sensitization. (IV) The FIT results should be compared to results of intracutaneous testing (mast cell sensitization) and testing of flea saliva specific IgE antibodies in serum to assess the validity of the FIT (basophil sensitization). In summary, it was possible to gain new knowledge about mechanisms of sensitization of feline basophils by parallel detection of total cellular histamine content, general sensitization, and specific sensitization of basophils in the FIT. Under the influence of weekly repeated antigen exposure (approx 100 C. felis per cat) a group of 14 laboratory cats showed individual differences in degree and kinetics of specific sensitization to one allergen preparation of C. felis. Three different reaction patterns could be summarized: cats that constantly reacted positively with an increase in their degree of sensitization during the course of flea exposure, cats that never developed a measurable degree of sensitization, and cats that were negative in the beginning and became sensitized during the course of flea exposure. The development of sensitization could be detected with the FIT after 16 - 24 weeks of flea exposure. Furthermore it could be shown that cats could loose induced basophil sensitization after seven weeks without without flea exposure. A special feature of the FIT was the detection of cats that were specifically sensitised against C. felis, but clinically healthy. However, the regulatory mechanisms that prevent clinical signs of allergy despite functional sensitization remain unclear. Additionally sensitization of mast cells (shown by IDT) has always shown clear agreement with sensitization of basophils (shown by FIT) in the experimental cats. However, sensitization of basophils did not necessarily correlate with the serum IgE titre against flea saliva antigens at the times tested. There was no agreement between FIT and ELISA in the beginning (at weeks -3 and 14) of the study when the whole flea extract, which was applied in the FIT, was used as an antigen for the ELISA. However at the end of flea exposure (at week 28) there was a clear agreement between results of these tests. Moreover basophil sensitization has been a more sensitive and faster indicator of type I sensitization than mast cell sensitization. Thus, the FIT was shown to be a sensitive method for monitoring type I sensitization of feline allergic effector cells. Therefore, the FIT might provide an immunological supplement to the clinical diagnosis of flea bite hypersensitivity in cats. However, further investigations are needed to evaluate sensitivity and specificity of this test under field conditions. Furthermore, assessment of relevant immunoglobulin isotypes that are bound of Fc-receptors on basophils could provide important information about the quality of sensitization.

Die Flohspeichelallergie ist eine der häufigsten Ursachen für Hauterkrankungen bei Katzen. Um einen Verdacht auf Flohspeichelallergie zu äußern, müssen die Tiere eine Reihe anamnestischer und klinischer Kriterien erfüllen. Zur immunologischen Absicherung der klinischen Verdachtsdiagnose und zur Ermittlung des auslösenden Allergens stehen gegenwärtig verschiedene in vivo und in vitro Methoden zur Verfügung. Diese weisen jedoch gerade für Katzen unzureichend exakte Ergebnisse auf. Der Wunsch, die für die Typ I Allergie verantwortlichen Vorgänge nachzuweisen, führte an der Arbeitsgruppe Immunologie zur Entwicklung eines funktionellen in vitro Tests (FIT) zur Diagnose der Typ I Allergie des Pferdes. Der FIT ermöglicht es, basophile Granulozyten in vitro auf ihre in vivo Sensibilisierung gegen bestimmte Allergene zu prüfen, um sensibilisierte von nicht-sensibilisierten Tieren zu unterscheiden. Dazu wird die nach Stimulation mit einer Allergen-Präparation selektiv aus Basophilen freigesetzte Histaminmenge bewertet (spezifische Sensibilisierung). Parallel dazu wird die Gesamthistaminmenge, die spontane Freisetzung und die generelle Fähigkeit Basophiler, nach Kreuzvernetzung membranständiger Immunglobuline zu degranulieren (generelle Sensibilisierung), überprüft. Ziel dieser Arbeit war es, mit dem FIT die Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten der Katze näher zu untersuchen, um ihre Eignung für eine in vitro Diagnostik der Flohspeichelallergie bewerten zu können. (I) Dazu sollte der FIT zur Testdurchführung mit gewaschenem Vollblut der Katze adaptiert werden. (II) Zum empfindlicheren Nachweis der Basophilen-Sensibilisierung sollten diese angereichert werden und dann mit denjenigen aus Vollblut im FIT verglichen werden. (III) Um zu überprüfen, ob sich Basophile der Katze als Indikator für eine C. felis–spezifische Typ I Sensibilisierung eignen, sollte mit dem FIT der Einfluss wiederholter Flohexpositionen auf den funktionellen Sensibilisierungsgrad feliner Basophiler geprüft werden. (IV) Zur Überprüfung der Aussagekraft des FIT als Meßsystem für eine funktionelle Basophilen-Sensibilisierung, sollten die Befunde des FIT mit denen aus dem Intrakutantest (Mastzellen-Sensibilisierung) und aus der Prüfung Flohantigen-spezifischer IgE-Antikörper im Serum verglichen werden. Zusammenfassend konnten durch die im FIT erhaltenen Parallelinformationen neue Erkenntnisse über das Sensibilisierungsverhalten basophiler Granulozyten der Katze gewonnen werden. Eine Gruppe von 14 Katzen, die über einen Zeitraum von sieben Monaten wöchentlich wiederholt ca. 100 C. felis pro Tier ausgesetzt wurde, zeigte individuelle Unterschiede in Grad und Verlauf der spezifischen Sensibilisierung gegen die Ctenocephalides-Präparation. Es ließen sich drei Sensibilisierungsmuster zusammenfassen: Katzen, bei denen sich eine bereits bestehende Basophilen-Sensibilisierung verstärkte; Tiere, die zu keiner Zeit eine Sensibilisierung zeigten und Katzen, die durch wiederholte Flohexpositionen eine Basophilen-Sensibilisierung entwickelten. Die Entwicklung der Sensibilisierung konnte nach 16 – 24-wöchiger Antigenkonfrontation mit dem FIT nachgewiesen werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die durch wiederholte, kontrollierte Flohexpositionen induzierte Basophilen-Sensibilisierung nach 7-wöchiger Allergenkarenz weitgehend wieder verloren gehen kann. Eine Besonderheit des FIT lag ferner in der Erkennung spezifisch gegen C. felis sensibilisierter, aber klinisch gesunder Katzen. Die Art der Regulationsmechanismen, die trotz einer funktionell ausreichenden Sensibilisierung die klinische Ausprägung der Allergie verhindern, ist jedoch bis heute unklar. Während die nachweisbare Sensibilisierung der Mastzellen (im Intrakutantest) und der Basophilen (im FIT) in der untersuchten Katzenpopulation weitgehend übereinstimmten, zeigte die Basophilen-Sensibilisierung keine Übereinstimmung mit dem Spiegel an freien IgE-Antikörpern gegen Flohspeichelantigene im Serum. Wurde jedoch die gleiche Ganzfloh-Präparation, die im FIT eingesetzt wurde, auch als Antigen im IgE-ELISA genutzt, so zeigte sich anfangs (Woche -3 und 14) keine und am Ende der Expositionsphase (Woche 28) eine deutliche Übereinstimmung mit den FIT-Ergebnissen. Die Basophilen-Sensibilisierung war außerdem ein empfindlicherer und schnellerer Indikator für eine Typ I Sensibilisierung als die Mastzellen-Sensibilisierung. Es zeigte sich also, dass der FIT ein empfindliches Nachweisverfahren für eine funktionelle Typ I Sensibilisierung feliner allergischer Effektorzellen ist. Somit stellt der FIT ein klinisch relevantes Verfahren zur Prüfung der Grundvoraussetzung für eine Flohallergie bei Katzen dar, ohne die Tiere durch den Nachweis zu belasten. Dazu sollte in zukünftigen Untersuchungen die Sensitivität und die Spezifität dieses Verfahrens unter Feldbedingungen ermittelt werden. Ferner könnte eine Untersuchung der an die Fc-Rezeptoren auf Basophilen gebundenen Immunglobulin-Isotypen zur Beurteilung der Qualität der Sensibilisierung wichtig werden.

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Stuke, Kristin: Entwicklung eines funktionellen in vitro Test (FIT) zur Prüfung der Sensibilisierung feliner basophiler Granulozyten von Katzen mit kontrollierter Flohexposition (Ctenocephalides felis felis). Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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