Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung des IBV-Spike-Proteins

Winter, Christine

Infectious bronchitis virus (IBV) is the prototype Coronavirus. Infection occurs mainly in chickens of all ages. Infected chickens show respiratory symptoms and damage of the reproductive tract. Some strains have a predilection for the kidney resulting in nephritis and nephrosis. Although vaccination strategies are applied worldwide, IBV infection still causes problems because of the appearence of new strains and variants. Infectious bronchitis is economically one of the most important poultry diseases. While for several other coronaviruses cellular receptors are already known, no surface molecule has been identified yet, that enables binding of IBV particles. The binding of coronaviruses to the host cell is mediated by their spike proteins. The IBV spike protein shows sialic acid binding activity; it induces haemagglutination by binding to sialic acids on the surface of erythrocytes.   Desialylation experiments showed, that sialic acids play an important role during infection of cultered cells with IBV. After removal of sialic acids from the cell surface by neuraminidase treatment, the cells become resistant to an IBV infection. This could be demonstrated with two IBV strains and three different cell llines. Removal of only the a2,3 linked sialic acids turned out to be sufficient, to abolish an IBV Infection. This finding allows the conclusion that a2,3 linked sialic acids serve as receptor determinant for IBV on cultured cells. However, the affinity of IBV to sialoglycoconjugates is significantly weaker than those of influenza A virus or Sendai virus. To characterise the binding site on the spike protein with virial pseudotypes in future experiments , it is important that the S protein is expressed on the cell surface of transfected cells. the intracellular localisation of the S protein was analysed. Expression of the S protein in two different cell lines with the plasmids pTM1 or pCG1 demonstrated, that the IBV spike protein is retained at an intracellular compartment. Analysis of the sequence of the cytoplasmic tail by S protein mutants, showed that the second tyrosine within the sequence YYTTF is essential for the intracellular retention of the spike protein. If this tyrosine is replaced by an alanine, the S protein is transported to the cell surface. A function of this motif as a endocytosis signal could be excluded. Colocalisation studies of the S protein with marker proteins of endoplasmatic reticulum, ER-Golgi-intermediate compartement (ERGIC) and Golgi apparatus showed some colocalisation with all three marker proteins. The clearest colocalisation was seen with the marker protein of the Golgi apparatus. The results of expression experiments show that the cellular retention maschinery  retains the S protein in the Golgi apparatus.

Das Virus der Infektiösen Bronchitis der Hühner ist ein Coronavirus. Es infiziert vornehmlich Hühner aller Altersklassen. Erkrankte Tiere zeigen vor allem respiratorische Symptome und Schädigungen des Legeapparates. Manche Stämme zeigen einen ausgeprägten Nierentropismus und rufen Nephritis und Nephrose hervor. Obwohl gegen die Infektiöse Bronchitis weltweit Impfstrategien angewendet werden, macht das Auftreten immer neuer Stämme eine IBV-Infektion problematisch. Die Infektiöse Bronchitis zählt zu den wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen des Wirtschaftsgeflügels. Während für andere Coronaviren bereits bekannt ist, an welche zellulären Rezeptoren die Viren binden, konnte für IBV noch kein Oberflächenmolekül gefunden werden, an welches IB-Virionen binden. Die Bindung der Coronaviren an die Wirtszelle wird über ihr Spike-Protein vermittelt. Das IBV-Spike-Protein besitzt eine Sialinsäure-Bindungseigenschaft. Es ist in der Lage, an Sialinsäuren auf der Oberfläche von Erythrozyten zu binden und somit eine Hämagglutination auszulösen.   Desialylierungsversuche mit Zellkulturen zeigten, dass Sialinsäuren für die Infektion von Zellkulturen durch IBV essentiell sind. Ein Abspalten der Sialinsäuren durch eine Neuraminidase-Behandlung der Zellen macht diese resistent gegenüber einer IBV-Infektion. Dies wurde mit zwei verschiedenen IBV-Stämmen und drei verschiedenen Zellinien gezeigt. Ein Entfernen der a2,3-gebundenen Sialinsäuren reicht aus, um eine IBV Infektion zu verhindern. Daraus kann gefolgert werden, dass IBV an a2,3-gebundene Sialinsäuren als Rezeptordeterminante auf Zellkulturen bindet. Die Affinität zu Sialoglykonjugaten ist jedoch deutlich schwächer ausgeprägt als bei den Vergleichsviren Influenza-A-Virus und Sendai-Virus. Um die Sialinsäurebindungstelle auf dem Spike-Protein in Zukunft mit Hilfe von sogenannten Pseudotypen charakterisieren zu können, muss das S-Protein auf der Zelloberfläche transfizierter Zellen exprimiert werden. Daher war es notwendig zunächst die zelluläre Lokalisation des Spike-Proteins zu untersuchen. Die Expression des S-Proteins in zwei verschiedenen Zelllinien mittels der Expressionsplasmide pTM1 und pCG1 zeigte, dass das S-Protein intrazellulär zurückgehalten wird. Eine Untersuchung der Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt des S-Proteins mit Hilfe von verschiedenen S-Protein-Mutanten ergab, dass das zweite Tyrosin der Sequenz YYTTF für die Retention vom Spike-Protein von entscheidender Bedeutung ist. Wird es durch Alanin ersetzt, so ist ein Transport des Proteins an die Zelloberfläche zu beobachten. Eine Endozytosewirkung dieses Motivs konnte ausgeschlossen werden. Eine Kolokalisation des S-Proteins mit Markerproteinen des Endoplasmatischen Retikulums, des ER-Golgi-intermediären Kompartiments (ERGIC) und des Golgi-Apparates zeigte, dass das S-Protein mit allen drei Markerproteinen eine gewisse Kolokalisation zeigt, wobei die größte Übereinstimmung mit dem Golgi-Apparatmarker zu erkennen ist. Die Expressionsergebnisse lassen den Schluss zu, dass der Rückhaltemechanismus  erst dann zu greifen scheint, wenn das S-Protein im Golgi-Apparat vorliegt

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Winter, Christine: Charakterisierung des IBV-Spike-Proteins. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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