Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Kryokonservierung von Hengstsperma mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes im Vergleich zur konventionellen Gefrierung in 0.5ml Pailletten

Zirkler, Heike

The present paper shall compare the cryopreservation of stallion semen by means of a directional freezing technique in Hollow-Tubes® with conventional freezing in 0.5 ml straws. In the examinations, there were used 36 ejaculates of 12 stallions (6 stallions with an empirically good suitability for freezing and 6 stallions with an empirically poor suitability for  freezing) that were frozen using the split-sample method. After centrifugation, the ejaculates were set to 60 and 200 million of spermatozoa per ml. The motility was analyzed by means of computer video-micrography (MIKA Motion Analyzer), the membrane integrity (SYBR®14/PI staining and SYTO®17/FITC-PNA/PI staining), the acrosomal status (SYTO®17/FITC-PNA/PI staining), the mitochondrial membrane potential (JC-1 staining) and the sperm chromatin structure (SCSA™) were analyzed with the help of flowcytometry (FACScan™, Becton Dickinson, Heidelberg) and used as assessment criteria. The directional freezing technique is characterized by a successive, partially advancing freezing at freezing rates that are far above those of already established methods.   The post-thawing qualities of the sperm samples frozen in the two packaging forms do not differ significantly from each other (p>0.05) with regard to the share of progressive motile sperm, to the curvilinear velocity, linear velocity, average velocity of the sperm and to the percentage of DFI sperm.   With regard to the two sperm concentrations used, there can be found a trend indicating an advantage of the samples with lower concentration as far as the examined motility parameters are concerned. Regarding the percentage of vital sperm and acrosome-stained sperm according to FITC-PNA/SYTO®17/PI staining, the frozen samples with 60 million of spermatozoa per ml show significantly better post-thawing qualities than the samples with a higher concentration (p<0.05).   The samples with 60 million spermatozoa per ml packaged in straws delivered the significantly best post-thawing results (p<0.05) in terms of the share of vital sperm according to FITC-PNA/SYTO®17/PI staining and of the percentage of spermatozoa with a high mitochondrial membrane potential compared with the other frozen samples.   A significant superiority (p<0.05) of the post-thawing results of the sperm samples from the stallions with good freezability over the thawing results of the samples from the stallions with  poor freezability was found with regard to all motility parameters and the percentage of DFI sperm.   The examinations performed have shown that the freezing technology of directional freezing is a suitable method for freezing equine semen, while there was not found an advantage compared with conventional freezing in a commercial programmable machine with regard to the quality of the sperm samples post-thaw.

In der vorliegenden Arbeit sollten die Kryokonservierung von Pferdespermien mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes® und die konventionelle Gefrierung in 0,5 ml Pailletten verglichen werden. In den Untersuchungen wurden 36 Ejakulate von 12 Hengsten (6 Hengste mit empirisch guter Tiefgefriereignung, 6 Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung) verwendet, die im split-sample-Verfahren tiefgefroren wurden. Die Ejakulate wurden nach der Zentrifugation auf 60 und 200 Millionen Samenzellen/ml eingestellt. Die Motilität wurde mittels Computervideomikrographie (MIKA Motion Analyser), die  Membranintegrität (SYBR®14/PI-Färbung u. SYTO®17 /FITC-PNA/ PI-Färbung), der akrosomale Status (SYTO®17 / FITC-PNA / PI-Färbung), das Mitochondrienmembranpotential (JC-1-Färbung) und die Spermienchromatinstruktur (SCSA™) wurden mittels Durchflußzytometer (FACScan™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg)  analysiert und als Beurteilungskriterien eingesetzt. Die direktionale Gefriertechnologie ist gekennzeichnet durch eine sukzessive, partiell fortschreitende Gefrierung mit Einfriergeschwindigkeiten, die weit oberhalb jener von schon etablierten Verfahren liegt.    Die Auftauqualitäten der in den beiden Konfektionierungsformen tiefgefrorenen Spermaproben unterscheiden sich hinsichtlich des Anteils vorwärtsmotiler Spermien, der kurvolinearen Geschwindigkeit, der linearen Geschwindigkeit, der mittleren Geschwindigkeit der Spermien und des prozentualen Anteils an DFI-Spermien nicht signifikant voneinander (p>0,05).   Bezüglich der beiden verwendeten Samenzellkonzentrationen kann ein tendentieller Vorteil der niedriger konzentrierten Proben hinsichtlich der untersuchten Motilitätsparameter festgestellt werden. Beim prozentualen Anteil vitaler Spermien und akrosomgefärbter Spermien nach FITC-PNA / SYTO®17 / PI-Färbung weisen die mit 60 Millionen Samenzellen/ml tiefgefrorenen Proben signifikant bessere Auftauqualitäten auf als die höher konzentrierten Proben (p<0,05).   Die signifikant  besten Auftauresultate (p<0,05) hinsichtlich des Anteils vitaler Spermien nach FITC-PNA / SYTO®17 / PI-Färbung und des Prozentsatzes an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential lieferten die mit 60 Millionen Spermien/ml und in Pailletten konfektionierten Proben im Vergleich zu den anderen tiefgefrorenen Proben.   Eine signifikante Überlegenheit (p<0,05) der Auftauresultate der Spermaproben der Hengste mit empirisch guter gegenüber den  Auftauresultaten der Proben der Hengste mit schlechter Tiefgefriereignung wurde bei allen untersuchten Motilitätsparametern und beim prozentualen Anteil an DFI-Spermien festgestellt.   In den durchgeführten Untersuchungen hat sich die Gefriertechnologie der direktionalen Gefrierung als geeignetes Verfahren für die Tiefgefrierung von Pferdespermatozoen erwiesen, wobei jedoch hinsichtlich der Auftauqualität der Spermaproben kein Vorteil gegenüber der konventionellen Gefrierung im Tiefgefrierautomaten festzustellen ist.

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Zirkler, Heike: Kryokonservierung von Hengstsperma mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes im Vergleich zur konventionellen Gefrierung in 0.5ml Pailletten. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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