Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende Untersuchungen über die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren in senilen Plaques im zentralen Nervensystem alter Hunde und Menschen

Paul, Silke Stephanie

The literature section provides a brief overview upon the pathogenesis of age-related changes in the brains of old dogs and Alzheimer’s disease (AD) in humans with special emphasis on Aß-protein deposits (senile plaques) and the development of the different plaque types. The role of the old dog as an animal model exhibiting neuropathological and cognitive changes similar to the ones in clinically healthy aged humans and in patients with Alzheimer’s disease is lined out. Furthermore, structure, function and biological properties of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) as well as their implications in physiological and pathological conditions including Alzheimer’s disease are presented.   In a preliminary screening, formalin-fixed and paraffin-embedded brain tissue of the frontal lobe of 32 dogs (2 to 18 years) was analyzed immunohistologically to detect Aß deposits in vessels and senile plaques. Plaque densities (number of plaques per 10 mm2 brain tissue) were evaluated and the animals were classified into different groups according to their age and the presence or absence of senile plaques in the CNS. Five young dogs (group 1, 2-3 years), five old dogs without plaques (group 2, 9-17 years) and ten old dogs with plaques (group 3, 10-18 years) as well as brain tissue of the hippocampal formation of seven human Alzheimer patients (group 5, 72-81 years) and one neurologically healthy human control patient (group 6, 44 years) have been investigated both histochemically and immunohistochemically. HE-staining of the sections allowed the diagnosis of age-dependent histological changes. Aß deposits in plaques and vessels were visualized by Aß-immunohistochemistry and silver-staining using the Campbell-Switzer method. Fibrillary Aß-deposits were detected with Congo-red and neurofibrillary tangles as well as neuritic changes were visualized employing the Gallyas silver stain. Further lectin-histochemical and immunohistochemical investigations included the detection of astrocytes (GFAP), microglia/macrophages in humans (CD68) and dogs (BS-1) and synaptophysin as well as MMPs and TIMPs (MMP-1, -3 , -7, -9, -12, -13, -14, latent MMP-2 ad TIMP-1 and -2). Double-labelling was performed in order to characterize MMP- and TIMP-positive cells or to confirm a suspected association of MMP- and TIMP-positive cells with plaques.   In the brains of the aged dogs, Aß deposits were detected in meningeal and parenchymal vessels as well as in diffuse plaques in the grey matter. Diffuse plaques lacking glial cell reactions were the only plaque type found in the aged canine brain. In one dog, however, a few plaques showed morphologic similarities with primitive plaques and were associated with weak glial cell reactions. Fibrillary Aß was present in blood vessels (congophilic angiopathy), whereas all plaques were devoid of fibrillary Aß and neither neurofibrillary tangles nor neuritic plaque components could be detected. The brains of the AD patients exhibited the characteristic distribution of Aß-deposits in Alzheimer’s disease in vessels and plaques (diffuse, primitive, classic and "burnt-out" senile plaques) as well as neurofibrillary tangles. Primitive and classic plaques were associated with extensive microglial and astrocytic cell activation and contained varying degrees of fibrillary Aß and neuritic structures.   In the dog brains, nearly all MMPs and TIMPs showed varying degrees of weak to moderate  immunoreactivity in meningeal cells, vessel walls of meningeal and parenchymal vessels in grey and white matter, neurons and single astrocytes, which corresponds to the constitutive expression of MMPs and TIMPs in the adult canine CNS. In general, nearly all MMPs and TIMPs showed a slightly higher immunoreactivity in the brains of young dogs compared with the old dogs. Between the old dogs with and without plaques statistically significant differences in the MMP- and TIMP-expression patterns were detectable only for MMP-1 and TIMP-1. In the grey matter of the old dogs without plaques, the amount of MMP-1-positive vessels was significantly higher than in the brains of old dogs with plaques, whereas the amount of TIMP-1-positive neurons was significantly higher in old dogs with plaques. The meaning and significance of the detected differences in MMP-1- and TIMP-1-immuno-reactivities in the brains of old dogs with and without plaques remains unclear. However, no MMP- or TIMP-staining of plaques and/or plaque-associated cells could be demonstrated in the brains of old dogs with plaques and no evidence of an MMP- and TIMP-involvement in the development of diffuse plaques in the brains of aged dogs was detected. In the brains of the Alzheimer and control patients, MMPs and TIMPs showed variable expressions in ependymal cells, subependymal glial cells, epithelium cells of the choroid plexus, vessel walls, astrocytes, microglia and occasionally in neurons. Immunoreactivity was weak to moderate and corresponded to the low constitutive expression of MMPs and TIMPs in the adult human CNS. However, some MMPs and TIMPs such as MMP-1, -9, -13 and TIMP-1 showed a significant up-regulation in the AD brains. A striking and to date not reported finding was the MMP-13 expression in enlarged and activated microglia/ macrophages associated with primitive plaques, most markedly in the subiculum. MMP-13 may either be secreted due to microglial stimulation by various cytokines present in primitive plaques or as a result of a MMP-TIMP-imbalance in the AD tissue. Since activated MMP-9 is capable of degrading Aß in vitro, MMP-13 could indirectly contribute to plaque resolution and prevent the deposition of Aß by its ability of activating proMMP-9. However, the underlying pathogenic mechanisms involved in this plaque-associated MMP-13-expression and their role in plaque development are currently not known and further studies are needed to clarify this issue.   In summary, this study revealed no evidence of MMP- and TIMP-involvement in the formation of diffuse plaques in the brains of dogs. Furthermore, elevated MMP- and TIMP-levels in the brains of Alzheimer patients were exclusively associated with primitive and classic plaques and not with diffuse plaques. This indicates that in humans as well as in dogs, MMPs and TIMPs do not seem to play a significant role in the development of diffuse plaques. Since the brains of old dogs exhibit predominantly these earliest stages of plaque evolution, the aged dog is apparently no appropriate animal model to study MMP- and TIMP-related Alzheimer’s disease pathology. However, the old dog is an excellent and valuable animal model to investigate other aspects and parameters associated with early changes in the brains of Alzheimer’s disease patients.

Die Literaturübersicht bietet einen kurzen Überblick über die Pathogenese altersbedingter Veränderungen in den Gehirnen von Hunden und an Morbus Alzheimer erkrankten Menschen. Ein Schwerpunkt liegt dabei auf der Beschreibung von Aß-Proteinablagerungen (senilen Plaques) und der Entwicklung der verschiedenen Plaquetypen. Des Weiteren wird die Bedeutung des alten Hundes als Tiermodell für neuropathologische und kognitive Veränderungen im Gehirn sowohl klinisch gesunder alter Menschen als auch von   Alzheimer-Patientinnen und -Patienten aufgezeigt. Darüber hinaus werden Struktur, Funktion und biologische Eigenschaften der Enzymfamilie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihren Inhibitoren ("Tissue inhibitors of metalloproteinases", TIMPs) dargestellt und ihre Rolle im Rahmen physiologischer und pathologischer Prozesse unter besonderer Berücksichtigung der Alzheimer-Krankheit erläutert.   In den Voruntersuchungen wurde Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gehirngewebe des Lobus frontalis von 32 Hunden im Alter von zwei bis achtzehn Jahren immunhistologisch auf das Vorhandensein von Aß-Proteinablagerungen in senilen Plaques und Gefäßen untersucht. Die Plaquedichte (Plaquezahl pro 10 mm2 Gehirngewebe) wurde ermittelt und für die weiterführenden Untersuchungen wurden fünf junge Hunde (Gruppe 1, 2 - 3 Jahre), fünf alte Hunde ohne Plaques (Gruppe 2, 9 - 17 Jahre) und die zehn alten Hunde mit der höchsten Plaquedichte ausgewählt (Gruppe 3, 10 - 18 Jahre). Für die Untersuchungen beim Menschen standen Paraffinschnitte der Hippocampusformation von sieben Alzheimer-Patientinnen und -Patienten (Gruppe 5, 72 - 81 Jahre) und eines neurologisch unauffälligen Kontroll-Patienten (Gruppe 6, 44 Jahre) zur Verfügung. Zur Diagnose altersabhängiger histopathologischer Veränderungen wurden die Schnitte einer HE-Färbung unterzogen, während mittels Aß-Protein-Immunhistologie und der Silberfärbung nach Campbell-Switzer Aß-Proteinablagerungen in Gefäßen und Plaques visualisiert wurden. Zur Detektion des fibrillären Aß-Proteins wurde eine Kongorot-Färbung eingesetzt und  neurofibrilläre Tangles und neuritische Plaquekomponenten mit der Silberfärbung nach Gallyas nachgewiesen. Weiterführende lektinhistochemische und immunhistologische Untersuchungen dienten der Detektion von Astrozyten (GFAP), Mikrogliazellen/Makrophagen bei Mensch (CD68) und Hund (BS-1), Synaptophysin sowie einer Reihe von MMPs und TIMPs (MMP-1, -3, -7, -9, -12, -13, -14, latentes MMP-2 sowie TIMP-1 und -2). Mittels Doppelmarkierungstechniken wurden MMP- und TIMP-exprimierende Zellen spezifiziert und vermutete Kolokalisationen der Zellen mit Plaques untersucht.   In den Gehirnen der alten Hunde lagen Aß-Proteinablagerungen sowohl in meningealen und parenchymalen Gefäßen als auch in senilen Plaques im Neuropil der grauen Substanz vor. Diffuse Plaques ohne assoziierte Gliazellreaktionen stellten die einzige in den Hundegehirnen nachweisbare Plaqueform dar. Lediglich im Gehirn eines alten Hundes fanden sich einige wenige, morphologisch an primitive Plaques erinnernde senile Plaques mit geringgradigen Gliazellreaktionen. Während in den Gefäßen fibrilläres Aß-Protein nachgewiesen werden konnte (kongophile Angiopathie), waren die Plaques im Hundegehirn frei von fibrillärem Aß-Protein und neuritischen Komponenten. Auch neurofibrilläre Tangles konnten nicht nachgewiesen werden. In den Gehirnen der Alzheimer-Patientinnen und -Patienten lagen alle Plaqueformen (diffuse, primitive, klassische und "burnt-out" Plaques) sowie neurofibrilläre Tangles in den für die Alzheimer-Krankheit charakteristischen Gehirnregionen vor. In primitiven und klassischen Plaques fanden sich eine ausgeprägte Gliazellaktivierung sowie fibrilläres Aß-Protein und neuritische Komponenten.   In den Gehirnen der untersuchten Hundegruppen konnten MMPs und TIMPs in Meningealzellen, Gefäßwänden meningealer und parenchymaler Gefäße in grauer und weißer Substanz, der Tunica media, Neuronen und einzelnen Astrozyten nachgewiesen werden. Die gering- bis mittelgradigen Immunreaktivitäten sind Ausdruck der geringen konstitutiven MMP- und TIMP-Expression im zentralen Nervensystem (ZNS) adulter Hunde. Die meisten MMPs und TIMPs zeigten bezüglich Intensität und Anzahl der positiven Signale in den Gehirnen der jungen Hunde im Vergleich mit den alten Hunden ohne und mit Plaques eine geringgradig höhere Ausprägung. Zwischen den alten Hunden ohne und mit diffusen Plaques lagen lediglich für MMP-1 und TIMP-1 statistisch signifikante Unterschiede bezüglich der Intensität und der Anzahl der MMP- und TIMP-Immunreaktivitäten vor. So zeigten die alten Hunde ohne Plaques eine signifikant höhere Anzahl MMP-1-positiver Gefäße in der grauen Substanz, während in den Gehirnen alter Hunde mit Plaques eine signifikant höhere Anzahl TIMP-1-positiver Neuronen vorlag. Die Bedeutung der detektierten Unterschiede der MMP-1- und TIMP-1-Expressionsmuster in den Gehirnen alter Hunde ohne und mit Plaques bleibt unklar. Für alle untersuchten MMPs und TIMPs konnte in den Gehirnen der alten Hunde mit Plaques jedoch keine Markierung diffuser Plaques und/oder Plaque-assoziierter Zellen nachgewiesen werden, so dass keine Hinweise auf das Vorliegen einer MMP-und TIMP-Beteiligung bei der Entstehung diffuser Plaques im Hundegehirn vorliegen.   Die Gehirne der Alzheimer-Patientinnen und -Patienten sowie des Kontroll-Patienten zeigten MMP- und TIMP-Expressionen in Ependymzellen, subependymalen Gliazellen, den Epithelzellen des Plexus choroideus, in Gefäßwänden, vereinzelten Mikrogliazellen und Astrozyten sowie in einzelnen Neuronen. Die Immunreaktivitäten waren von gering- bis mittelgradiger Intensität und somit Ausdruck der niedrigen, konstitutiven Expression der verschiedenen MMPs und TIMPs im adulten menschlichen ZNS. In den Gehirnen der Alzheimer-Patientinnen und -Patienten zeigten MMP-1, -9, -13 und TIMP-1 im Vergleich zu dem Kontroll-Patienten eine deutliche Aufregulierung. Die MMP-13-Expression in stark aktivierten und mit primitiven Plaques assoziierten Mikrogliazellen/Makrophagen stellt ein überraschendes und so in der Literatur bisher noch nicht beschriebenes Ergebnis der vorliegenden Studie dar. Die MMP-13-Expression könnte durch die verschiedenen, in primitiven Plaques vorhandenen Zytokine stimuliert sein oder aber durch eine MMP-/TIMP-Imbalance im Gehirn von Alzheimer-Patientinnen und -Patienten induziert werden. Möglicherweise trägt MMP-13 durch die Aktivierung von latentem MMP-9 indirekt zum Abbau des Aß-Proteins bei. Die der Plaque-assoziierten MMP-13-Expression zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismen sowie ihre Rolle im Rahmen der Plaqueentwicklung sind jedoch bislang unbekannt und geben Anlass zu weiteren Untersuchungen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in der vorliegenden Studie keine Hinweise auf eine Beteiligung von MMPs und TIMPs bei der Entstehung diffuser Plaques im Gehirn alter Hunde gefunden werden konnte. In den Gehirnen der Alzheimer-Patientinnen und -Patienten lagen die detektierten MMP- und TIMP-Aktivitäten ausschließlich in Verbindung mit primitiven und klassischen Plaques vor, so dass MMPs und TIMPs im frühsten Stadium der Plaquentwicklung sowohl bei Hunden als auch Menschen eine untergeordnete Rolle zu spielen scheinen. Da im Gehirn alter Hunde vornehmlich diffuse Plaques und damit die Frühstadien der Plaqueentwicklung auftreten, ist der alte Hund zur Untersuchung der Rolle der MMPs und TIMPs im Rahmen der Alzheimer-Krankheit des Menschen nicht geeignet. Er stellt jedoch ein wertvolles Tiermodell für die Erforschung anderer, mit den Frühstadien der Alzheimer-Krankheit assoziierten Parametern dar.

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Paul, Silke Stephanie: Vergleichende Untersuchungen über die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren in senilen Plaques im zentralen Nervensystem alter Hunde und Menschen. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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