Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of the heparin-binding activity of the bovine respiratory syncytial virus fusion protein

Panayotova Dimitrova, Diana

Cell surface glycosaminoglycans (GAGs) are a major factor for respiratory syncytial virus (RSV) attachment to cultured cells leading to infection. The viral glycoprotein G binds to GAGs and was thought to be the only viral attachment protein. Recently, mutant virus lacking the G protein was shown to be infectious in cell culture suggesting that the F protein, which has long been known for its fusion activity has also receptor binding activities. A linear heparin-binding domain has been identified in the G protein. This domain is characterized by clusters of basic amino acids that are supposed to be important for the interaction with the negatively charged groups of GAGs. The respective domains in the F protein responsible for the interaction with GAGs are not known so far.   The present study was based on the working hypothesis that basic amino acids concentrated in a short domain located in the BRSV fusion protein F2 subunit are involved in heparin-binding. The experimental work was designed to provide a better understanding of the interaction between BRSV F protein and heparin-like structures. Recombinant BRSV with mutations in the putative-heparin binding domain of the F2 subunit were analyzed. The significance of these mutations with respect to virus infectivity and heparin binding were investigated.   The following results were obtained:   First, 13 recombinant viruses containing point mutations in the F2 subunit of the F protein were generated and characterized with respect to replication and syncytia formation.   Second, an essential role of lysine K75 in F protein function was demonstrated.  Analysis of transfected cells revealed that this mutation do not affect either proteolytic activation, or cell surface transport of the F protein, but had an effect on fusion activity. Like K75N, no virus could be recovered from mutant K77N. The reason for this is unclear.   Third, inhibition of BRSV infection indicated that the basic amino acids K63, K66, K80, and R85 have modulating effects on virus infectivity.   Fourth, it was demonstrated that even higher concentrations of soluble heparin did not completely abolish virus infection suggesting the existence of additional cellular receptors which are involved in viral attachment.

Glukosaminoglykane (GAG) auf der Zelloberfläche sind ein wichtiger Faktor für die Bindung des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) an Zellen bei der Einleitung einer Infektion. Das virale Glykoprotein G bindet an GAG und galt früher als alleiniges Anheftungsprotein. Kürzlich wurde gezeigt, dass Virusmutanten, denen das G-Protein fehlt, Zellkulturen infizieren können. Daraus folgt, dass das F-Protein neben seiner bekannten Fusionsaktivität auch über Rezeptor-bindende Aktivität verfügt. Auf dem G-Protein ist eine lineare Heparin-bindende Domäne identifiziert worden. Dieser Proteinabschnitt ist gekennzeichnet durch eine Anhäufung basischer Aminosäuren, von denen man annimmt, dass sie für die Wechselwirkung mit den negativ geladenen Gruppen von GAG wichtig sind. Eine entsprechende für die Wechselwirkung mit GAG verantwortliche Domäne war auf dem F-Protein bislang nicht bekannt. Die vorliegende Studie basiert auf der Arbeitshypothese, dass basische Aminosäuren, die in einem kurzen Abschnitt der F2-Untereinheit gehäuft auftreten, an der Heparin-Bindung beteiligt sind. Die experimentelle Arbeit war darauf ausgerichtet, ein besseres Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem BRSV-F-Protein und Heparin-ähnlichen Strukturen zu vermitteln. Rekombinantes BRSV mit Mutationen in der mutmaßlichen Heparin-Bindungsdomäne der F2-Untereinheit wurde analysiert. Die Bedeutung dieser Mutationen hinsichtlich Infektiosität und Heparin-Bindung wurde untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:   1. Dreizehn rekombinante Viren mit Punktmutationen in der F2-Untereinheit des F-Proteins wurden erzeugt und hinsichtlich Replikation und Synzytium-Bildung charakterisiert. 2. Für die Lysine K75 und K77 wurde eine essentielle Rolle für die Funktion des F-Proteins nachgewiesen. Die Analyse transfizierter Zellen zeigte, dass diese Mutationen weder die proteolytische Aktivierung noch den Oberflächentransport des F-Proteins beeinflussen, wohl aber die Fusionsaktivität (K75). Rekombinantes Virus mit diesen Mutationen konnte nicht isoliert werden.   3. Die Hemmung der BRSV-Infektion zeigte, dass die basischen Aminosäuren K63, K66, K80 und R85 einen modulierenden Effekt auf die Virusinfektiosität haben.   4. Es wurde gezeigt, dass selbst hohe Konzentrationen löslichen Heparins die Virusinfektion nicht völlig verhinderten. Dieses Ergebnis spricht für die Existenz eines zusätzlichen zellulären Rezeptors, der an der Virusbindung beteiligt ist.

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Panayotova Dimitrova, Diana: Characterization of the heparin-binding activity of the bovine respiratory syncytial virus fusion protein. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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