Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit substituierter Enzyme (Proteasen und Amylasen) am Modelltier pankreasgangligiertes Minischwein

Becker, Caroline

Treatment of patients with exocrine pancreatic insufficiency (EPI) requires supplementation of the missing pancreatic enzymes. Until now, the in vivo efficacy of newly developed enzymes have been investigated in 2-3 week digestibility trials e.g. using ileal fistulated Göttingen Minipigs. These tests work well, but are also very time-consuming, labour intensive and require large amounts of enzymes, which are not available in the early period of development of new enzyme products. The aim of this study was to develop screening tests, which in a single test meal would allow differentiation between enzymes regarding their in vivo efficacy and eventual selection of the most promising proteases and amylases from a number of candidate enzymes. The use of a single test meal required certain modifications to be made to the usual chyme collection protocol in the standard digestibility trial. To develop the tests, a pancreatic enzyme preparation (PEP) of proven efficacy was used as the standard. Following the successful demonstration of a dose-dependent response to the standard enzyme preparation, novel monoenzymes (4 proteases and 4 amylases) were tested in the respective screening tests by measuring their in vivo proteolytic respectively amylolytic efficacy on the praecaecal digestibility of the test meals. Based on these results it was possible to select the most efficacious enzymes. To validate the protease-screening tests, two proteases (best and worse in screening test) were used in the established digestibility trial. The studies were performed in 12 female Göttingen Minipigs (30 – 45 kg BW) all fitted with an ileo-caecal re-entrant fistula. Pancreatic exocrine insufficiency was additionally induced by ligation of the pancreatic duct (PL) in 8 of these pigs. The other 4 pigs served as controls (C). The animals were fed twice daily with 250 g of a regular diet (containing (%): 18.9 crude protein (cp), 4.98 crude fat (cfa), 3.03 crude fibre (cfi), 94.1 organic matter (om), 47.7 starch (st) in dry matter (DM)), mixed with 1 litre water. The test meals to assess the activity of the proteases (containing (%): 21.4 (cp), 2.57 cfa, 2.70 cfi, 92.2 om, 51.9 st in dry matter (DM)) and the amylases (high starch diet, containing (%): 15.3 cp, 2.06 cfa, 1.77 cfi, 94.3 om, 68.9 st in dry matter (DM)) were given only once on the morning of each test day. To each 250 g test meal was added 0,625 g Cr2O3 as marker and 1 litre water. At all other times, including the evening meal on test days, the pigs were fed the regular diet (without Cr2O3). The screening tests were initially established using a PEP of well known efficacy. Thereafter, four proteolytic respectively amylolytic enzymes of unknown efficacy, were administered separately with the test meal (at 0, 1 000, 2 500 and 6 000 FIP units protease resp. 0, 7 500, 18 750 and 90 000 FIP units amylase). Each enzyme and each dosage was tested on only one day. The allocation of the enzymes was randomised. Chyme collection started at the time of feeding the test meal and lasted up to 12 – 14 hours. Sampling of ileal chyme started when its colour turned green, which indicated the ileal arrival of the test meal (4. – 6. hour ppr.). The green chyme was collected over a period of 8 hours (proteases) resp. 6 hours (amylases) and analysed in restricted samples of intervals of 2 hours. The test meals and chyme samples were analysed for DM, Cr2O3 and cp (proteases) resp. st (amylases) according to standard VDLUFA methods. Between any two tests there was a minimum of 48 hours. To validate the protease-screening test, the efficacy of the best and worst performing proteases from the screening test were re-evaluated in the standard ileal digestibility trial: animals were fed twice daily with the protease screening test meal plus one of the test enzymes (one of two doses) for at least 10 days, after which ileal chyme was collected on three consecutive days over 12 hours (7:45 a.m. to 7:45 p.m.). Assessment of the efficacy of substituted proteolytic enzymes was done according to the amount of cp-appearance the cp-disappearance rate, and cp digestibility. All enzymes showed dose-dependent effects, even though clear differences in the efficacy, especially at the lowest dosage (1 000 FIP units) were seen between the four proteases. Using the screening test it was possible to differentiate between the four proteases. Compared to the control group (C = 100) the efficacy of the proteases at a dosage of 6 000 FIP units were: P1 84.4, P2 88.4, P3 63.9, P4 55.1. According to these results the ranking is: P2 > P1 > P3 > P4. This ranking was confirmed by the results of the two proteases tested in the 13 day digestibility trial, in which compared to the control group (c = 100 %) the efficacy with 6000 FIP units per meal was: P2 82.5, P4 69.5. According to these results the ranking is again: P2 > P4, although the difference between the enzymes was not so extreme as in the screening test. Assessment of the efficacy of substituted amylases was done on the base of the parameters amount of st-appearance and st-disappearance rate. All the amylases increased the stdisappearance rate in comparison with untreated PL pigs. Furthermore it was possible to clearly differentiate the amylases 1-3 from amylase 4. Compared to the control group (C = 100) the efficacy of the amylases at a dosage of 90 000 FIP units were: A1 97.0, A2 97.4, A3 97.3 A4 57.7. According to these results the ranking is: A1 = A2 = A3 > A4. Conclusions: The results from the digestibility trial confirmed that enzyme efficacy in vivo can be differentiated according to the efficacy of the enzymes in the screening test. The new test offers the possibility to screen proteases and amylases for in vivo efficacy using a single test meal. This test can be used to pre-select enzymes, and only those with promising results need to be tested in the established digestibility trial.

Die Behandlung der exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) erfolgt v.a. durch Substitution der fehlenden Pankreasenzyme. Die in-vivo Wirksamkeit neuentwickelter Produkte wurde bisher anhand von zeit- und arbeitsintensiven Verdaulichkeitsuntersuchungen am Modelltier pankreasgangligiertes Minischwein überprüft. Insbesondere der, durch die Versuchsdauer (~14 Tage) bedingte, hohe Verbrauch an Enzymen ist bei neuentwickelten Produkten nicht unproblematisch, da diese in frühen Phasen der Produktentwicklung oft noch nicht in entsprechenden Mengen zur Verfügung stehen. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines zeitsparenden Screening-Tests für in-vivo Reihenuntersuchungen von Proteasen und Amylasen. Der Screening-Test sollte mit einmaliger Gabe einer Testmahlzeit und entsprechender Enzymzulage eine Vorauswahl geeigneter Produkte ermöglichen; die Effekte einer Enzymzulage sollten also nach einmaliger Applikation mit einer Testmahlzeit bewertet werden. Die Chymusgewinnung wurde hierzu bezüglich des Kollektionszeitraumes modifiziert. Die Entwicklung des Screening-Tests erfolgte zunächst unter Verwendung eines Multienzymproduktes bekannter Wirksamkeit. Im Anschluss daran wurden Monoprodukte (4 Proteasen bzw. 4 Amylasen) im Screening-Test auf ihre Wirksamkeit geprüft, differenziert und anschließend rangiert. Zur Validierung des Screening-Tests wurden die Proteasen höchster bzw. geringster Effektivität vergleichend nach bisher üblichem Vorgehen getestet. Hierzu standen insgesamt zwölf adulte weibliche Göttinger Miniaturschweine (30-45 kg KGW) mit ileocaecaler Umleitungsfistel zur Verfügung. Bei 8 Tieren war der Ausführungsgang des Pankreas (Ductus pancreaticus accessorius) zur Simulation einer EPI ligiert (PLTiere), die übrigen 4 Tiere dienten als Kontrolltiere (KT). Nährstoffangaben der eingesetzten Testmahlzeiten (in % der TS): Protease-Screening: 21,3 Rp; 51,9 Stärke; 2,57 Rfe; 92,2 oS; 2,70 Rfa; Amylase-Screening: 15,3 Rp; 68,9 Stärke; 2,06 Rfe; 94,3 oS; 1,77 Rfa. Die Testmahlzeiten enthielten als Marker Cr2O3 (2,5 g / kg uS). Diese Testmahlzeiten wurden ledig lich am Morgen des Versuchstages gefüttert, abends und an versuchsfreien Tagen erhielten die Tiere ein Futter ähnlicher Zusammensetzung (% der TS: 18,9 Rp; 47,7 Stärke; 4,98 Rfe; 94,7 oS; 3,03 Rfa) ohne jeden Enzymzusatz. Die Futtermenge betrug stets 250 g (uS) je Tier und Mahlzeit. Die 4 Proteasen (P1-4) wurden im Screening-Test in drei Dosierungen (1 000, 2 500 und 6 000 I.E. FIP) eingesetzt. In der etablierten Verdaulichkeitsstudie wurden zwei Proteasen (P2 und P4) in jeweils zwei Dosierungen (1 000 und 6 000 I.E. FIP) und das Futter des Protease- Screening-Tests eingesetzt. Die 4 Amylasen (A1-4) wurden der entsprechenden Testmahlzeit in den Dosierungen 7 500, 18 750 sowie 90 000 I.E. FIP zugelegt. Der Kollektionszeitraum des Ileumchymus im Rahmen des Screenings für Proteasen erstreckte sich über 8 Stunden, im Screening-Test für Amylasen über 6 Stunden, beginnend nach Änderung der Chymusfarbe von braun zu grün (Farbwechsel: 4-6 h ppr.; Beginn der Anflutung der markerhaltigen Testmahlzeit am caudalen Ileum). Der Chymus wurde fraktioniert in 2- stündigen Intervallen gesammelt und analysiert. Jedes Enzym wurde in jeder Dosierung lediglich an einem Tag getestet, wobei zwischen den Versuchstagen mindestens ein Abstand von 48 Stunden lag. Die Zuteilung der Enzymdosierungen erfolgte randomisiert. Zur Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit im Validierungsversuch wurde nach 10-tägiger Anfütterungsphase an drei aufeinanderfolgenden Tagen über jeweils 12 Stunden (7:45 – 19:45 h) Ileumchymus aufgefangen. Für die Analysen kamen nur etablierte Standardverfahren der Futter- bzw. Chymusanalyse zur Anwendung. Die Beurteilung der Wirksamkeit zugelegter Proteasen erfolgte anhand der Parameter Rp- Anflutung und Rp-Verschwindensrate (Rp-VR) bzw Rp-Verdaulichkeit. Dosisabhängige Effekte waren bei allen Produkten erkennbar, wobei sich die Präparate insbesondere in der geringsten Dosierung (1 000 I.E. FIP) in ihrer Wirkung zum Teil deutlich unterschieden. Die Dosiseffekte fielen bei den Proteasen unterschiedlich stark aus. Im Screening-Test ließen sich die Proteasen in ihrer Wirksamkeit differenzieren und führten bei Einsatz in der höchsten Dosierung (6 000 IE FIP) im Vergleich zu den Kontrolltieren (intaktes Pankreas = 100 %) zu folgenden Werten: P1 84,4 %; P2 88,4 %; P3 63,9 %; P4 55,1 %. Die Rangierung der Proteasen aufgrund der Ergebnisse des Screening-Tests war somit folgende: P2 > P1 > P3 > P4. Die Protease mit höchster bzw. niedrigster Wirksamkeit ergaben im klassischen Vorgehen im Vergleich zu den Kontrolltieren folgende Werte (6 000 I.E. FIP): P2 82,5 % und P4 69,5 % (Rangierung: P2 > P4). Vergleicht man diese zwei Proteasen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit in beiden Testverfahren miteinander (Screening-Test vs. klassischer Verdauungsversuch) so waren die Unterschiede auch bei den verschiedenen Dosierungen deutlich erkennbar. Bei übereinstimmender Rangierung in beiden Testverfahren waren die Unterschiede zwischen den beiden Produkten im klassischen Vorgehen nicht ganz so ausgeprägt wie im Screening-Test. Die Amylasen wurden anhand der Stärke-Anflutung und Stärke-Verschwindensrate differenziert. Auch hier erfolgte durch die Enzymsubstitution eine Steigerung der Stärke-VR gegenüber den PL-Tieren ohne Enzymsubstitution (PL-0). Des Weiteren wurden wiederum dosisabhängige Effekte beobachtet, die produktabhängig unterschiedlich stark ausgeprägt waren. Die Amylase A4 konnte deutlich von den anderen 3 Amylasen differenziert werden. Im Vergleich zu den Kontrolltieren führten die Amylasen bei Einsatz in der höchsten Dosierung (90 000 I.E. FIP) zu folgenden Ergebnissen: A1 97,0 %; A2 97,4 %; A3 97,3 % und A4 57,7 %. Aufgrund der Ergebnisse ergibt sich folgende Rangierung: A1 = A2 = A3 > A4. Schlussfolgerung: Der hier vorgestellte Screening-Test erlaubt anhand der ileocaecal anflutenden Substratmengen eine Differenzierung der Wirksamkeit verschiedener Enzyme (Monoenzymprodukte), die sich im klassischen Vorgehen bestätigte. Kamen die beiden Tests vergleichend zur Anwendung (Screening vs. etablierte Verdaulichkeitsstudie) wurde eine übereinstimmende Rangierung der Enzymprodukte erkennbar. Somit steht mit dem neuentwickelten Screening-Test ein Schnelltest zur Verfügung, um Monoenzyme bezüglich ihrer Effizienz unter in-vivo-Bedingungen, d.h. direkt am Tier zu testen und zu differenzieren. Es bedarf jedoch besonderer Erwähnung, dass die im Test erfolgreichen Produkte auch noch hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau durch parallel substituierte Produkte bedürfen. Diese nächste Stufe der Evaluation dürfte prinzipiell ebenfalls mit einer Testmahlzeit im hier beschriebenen Modus möglich sein. Dadurch kann eine erste Vorauswahl getroffen werden, welche Produkte in etablierten, aber auch zeitaufwändigeren Verdaulichkeitsuntersuchungen näher quantifiziert werden sollen.

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Becker, Caroline: Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit substituierter Enzyme (Proteasen und Amylasen) am Modelltier pankreasgangligiertes Minischwein. Hannover 2005. Tierärztliche Hochschule.

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