Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses

Dierks, Claudia

The aim of this work was to perform a whole genome scan for the identification of quantitative trait loci (QTL) for equine osteochondrosis (OC), to identify positional candidate genes for this disease and to develop marker tests based on intragenic single nucleotide polymorphisms (SNPs). The first step of the whole genome scan included 157 microsatellite markers, genotyped for 104 progeny of 14 paternal half-sib families of Hanoverian warmblood horses, their dams and eight sires. The marker genotypes, the pedigree data and the phenotype data of the foals were analyzed using non-parametric linkage analysis based on identical by descent (IBD) mapping. Traits used were OC (fetlock and/or hock joints affected), OCD (fetlock and/or hock joints affected), fetlock OC, fetlock OCD, hock OC and hock OCD. In a second step 61 additional markers were chosen to refine putative QTL found in the first scan. Nineteen chromosome-wide significant QTL with error probabilities for LOD scores or Zmeans ≤ 0.05 for OC and OCD were located on 17 different equine chromosomes: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24 and 30. QTL for fetlock OC and hock OC were mostly mapped on different chromosomes, indicating that these traits may be inherited independently. A genome-wide QTL was found on ECA2p for fetlock OC and fetlock OCD. Due to the high number of QTL found for OC and OCD, the genome-wide QTL located on ECA2p and a chromosome-wide QTL located on ECA4q were chosen for further refinement. Three positional candidate genes located on ECA2p (COL8A2, COL16A1 and COL9A2) were mapped in horses for the first time by fluorescence in situ hybridization (FISH) and radiation hybrid (RH)-mapping. The complete genomic sequence of the equine collagen, type IX, alpha 2 (COL9A2) gene was determined. Thirty-two SNPs in COL9A2 were detected in a mutation scan of eight unrelated Hanoverian warmblood stallions, including a SNP in Exon 18 that affects the amino acid sequence of COL9A2. A comprehensive 5,000-rad radiation hybrid (RH) map of a 40 cM region on equine chromosome 4q12-q22 harbouring quantitative trait loci for equine OC was constructed including 29 gene-associated sequence tagged site (STS) markers. Three blocks of conserved synteny between horse and man were identified showing two chromosomal breakpoints in the segment of ECA4q12-q22. Breakpoint resolution in the human-equine comparative map was considerably improved. Furthermore, 31 new SNP-markers located on ECA2p and ECA4q were developed. Therefore, PCR primers were designed on the basis of BAC end and equine EST sequences. The PCR products of eight unrelated stallions were screened for SNPs. All newly developed 31 SNPs and three SNPs in the COL9A2 gene were used for fine mapping of the QTL locations for OC on ECA2p and ECA4q identified by the whole genome scan. The inclusion of SNP markers improved the test statistics on ECA2 as compared to the whole genome scan where only microsatellites were used. Regarding ECA2, the Zmean was highest in the interval from 29.51 to 30.09 cM. The functional candidate gene COL9A2 is located in the proximity of this interval. For ECA4q the highest Zmean-value was reached at 66 cM. A SNP in the B1 gene of ECA4 was significantly associated with hock OC and hock OCD, whereas all other SNPs on ECA4 did not show significant linkage disequilibrium or association with traits of OC. The additive genetic effects of this B1 SNP were -0.85 for hock OC and  -0.83 for hock OCD and the significant dominance effects for hock OC were 0.47 and 0.53 for hock OCD. These results indicate that genes which are involved in the development of OC are located on ECA2p and ECA4q. The refinement of the two QTL found for OC was a first step towards the identification of genes responsible for equine OC. An intragenic SNP marker of the B1 gene on ECA4q showed a population-wide linkage disequilibrium for the traits hock OC and OCD, and appeared as a suitable marker for these traits in Hanoverian warmblood horses.

Ziel dieser Arbeit war es, mittels eines Genomscans Quantitative Trait Loci (QTL) für Osteochondrose (OC) beim Hannoverschen Warmblut zu identifizieren. Es sollten positionelle Kandidatengene für diese Erkrankung beim Pferd identifiziert werden, um mit Hilfe von intragenischen Einzelnukleotidaustauschen (SNPs) Markertests für OC zu entwickeln. Im ersten Schritt des Genomscans wurden 157 Mikrosatellitenmarker für 104 Nachkommen von 14 väterlichen Halbgeschwisterfamilien des Hannoverschen Warmbluts sowie die dazugehörigen Stuten und acht Hengste genotypisiert. Die Markergenotypen, die Pedigreedaten und die Phänotypinformationen der Fohlen wurden mittels einer nicht-parametrischen Kopplungsanalyse ausgewertet, die auf dem „identical by descent“ (IBD) Verfahren basierte. Für die Merkmale OC im Fessel- und Sprunggelenk, OCD im Fessel- und Sprunggelenk, OC im Fesselgelenk, OCD im Fesselgelenk, OC im Sprunggelenk und OCD im Sprunggelenk wurden getrennte Berechnungen durchgeführt. In einem zweiten Schritt wurden zur Feinkartierung von potentiellen QTL 61 zusätzliche Mikrosatellitenmarker ausgewählt und an dem Familienmaterial genotypisiert. Es wurden 19 chromosomenweit signifikante genomische Regionen mit Irrtumswahrscheinlichkeiten für LOD score- oder Zmean-Werte ≤ 0.05 für OC identifiziert. Diese QTL verteilten sich auf insgesamt 17 verschiedene Pferdechromosomen: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24 und 30. QTL für OC/OCD im Fesselgelenk waren überwiegend auf anderen Chromosomen lokalisiert wie QTL für OC/OCD im Sprunggelenk. Ein QTL auf dem Pferdechromosom 2p erreichte für das Merkmal OC im Fesselgelenk genomweite Signifikanz. Aufgrund der zahlreichen QTL wurden zwei viel versprechende QTL Regionen auf ECA2p sowie ECA4q zur Feinkartierung ausgewählt. Drei positionelle Kandidatengene (COL8A2, COL16A1 and COL9A2) wurden zum ersten Mal physikalisch mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und Radiation Hybrid (RH)-Kartierung auf ECA2p beim Pferd kartiert. Die vollständige genomische Sequenz des equinen collagen, type IX, alpha 2 (COL9A2) Gens wurde determiniert. Im COL9A2 Gen wurden 32 SNPs mit Hilfe einer Mutationsanalyse an acht unverwandten Hengsten des Hannoverschen Warmbluts identifiziert, wovon ein SNP in Exon 18 einen Aminosäureaustausch in der kodierenden Sequenz des Gens bewirkt. Für eine QTL-Region von 40 cM auf ECA 4q12-q22 wurde eine vergleichende 5,000-rad Radiation Hybrid (RH) Karte mit 29 genassoziierten „sequence tagged site“ (STS) Markern erstellt. Drei Abschnitte mit konservierter Syntenie zwischen Pferd und Mensch wurden identifiziert mit zwei chromosomalen Bruchpunkten im Vergleich zum Menschen. Die RH-Kartierung führte zu einer verbesserten Aufklärung der Syntenie und der Bruchpunkte im Pferdegenom im Vergleich zum menschlichen Genom und ist somit ein wertvoller Beitrag für die Entwicklung einer hoch auflösenden vergleichenden Genkarte von Mensch und Pferd. Zur weiteren Feinkartierung der Bereiche auf ECA2p und ECA4q wurden insgesamt 31 neue SNPs entwickelt. Die PCR Primer wurden mit Hilfe von equinen BAC End- und EST-Sequenzen entwickelt. Es wurden acht unverwandte Hengste auf SNPs untersucht. Alle neu entwickelten 31 SNPs und drei SNPs im COL9A2 Gen wurden zur Feinkartierung der QTL-Regionen für Osteochondrose auf ECA2p und ECA4q verwendet. Durch die Hinzunahmen der SNPs konnte in einer folgenden Kopplungsanalyse die Lokalisation der QTL bestätigt werden. Auf ECA2 erreichte der Zmean Maximalwerte in einem Intervall von 29.51 bis 30.09 cM. Das funktionelle Kandidatengen COL9A2 ist in der Nähe dieses Intervalls lokalisiert. Auf ECA4q wurde der höchste Zmean-Wert bei 66 cM ermittelt. Von den SNPs auf ECA4q war ein SNP im B1 Gen für die untersuchten Tiere signifikant mit den Merkmalen Osteochondrose bzw. Osteochondrosis dissecans im Sprunggelenk assoziiert. Der signifikante additive Effekt betrug für den im B1 Gen lokalisierten SNP -0.85 für das Merkmal Sprunggelenksosteochondrose und -0.83 für Osteochondrosis dissecans im Sprunggelenk. Die entsprechenden signifikanten Dominanzeffekte betrugen 0.47 bzw. 0.53.    Die Ergebnisse der Feinkartierung lassen vermuten, dass die Genorte auf Chromosom 2p und 4q Gene beherbergen, die an der Entstehung der Osteochondrose beteiligt sind. Die Feinkartierung dieser zwei QTL war ein erster Schritt im Hinblick auf die Identifizierung von für Osteochondrose verantwortlichen Genen. Ein intragenischer SNP-Marker im B1 Gen auf ECA4q zeigte ein populationsübergreifendes Kopplungsungleichgewicht für die Merkmale Osteochondrose bzw. Osteochondrosis dissecans im Sprunggelenk, und scheint somit ein brauchbarer Marker für diese Merkmale bei Hannoverschen Warmblutpferden zu sein.

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Dierks, Claudia: Molecular genetic analysis of quantitative trait loci (QTL) for osteochondrosis in Hanoverian warmblood horses. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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