Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunisierung von Muttersauen mit definierten Hapten-Carrier-Komplexen zur Prüfung des Konzeptes der Idiotyp-Vakzinierung von Ferkeln nach Kolostrumaufnahme

Gellermann, Maria

The increasing intensification of pig keeping has led to high animal concentrations which fa-vour the spreading of infectious diseases. Vaccinations against many pig diseases have gained enormous relevance. The specific application of an antigen prior to infection induces an immune response which avoids an infectious disease after pathogen contact or reduces at least the clinical conse-quences. Vaccination problems arise since some pathogens of loss-causing diseases spread in the fourth till tenth life week after weaning. Since the time between vaccination and the gen-eration of sufficient antibody levels can take between two and four weeks, vaccinations are more and more performed during the suckling time. Sows are usually also infected by the pathogens, generate antibodies and transfer them into the colostrum. Thus, piglets which took up colostrum still have maternal antibodies against the pathogen or vaccine at the time of immunization during their first weeks of life. The sig-nificance of persistent maternal antibodies for an active immune response of the piglets is still a matter of discussions. They are based almost exclusively on investigations in which the quality of the immune response is derived from the amount of serum antibodies. There is still a lack of fundamental knowledge about qualitative effects of maternal antibodies for the im-munity in piglets and the relevance of the major IgG isotypes (IgG1 and IgG2) for mecha-nisms of porcine maternal-neonatal immune regulation. The present study aimed at the demonstration of the immune response after vaccination with model antigens. The model antigens consisted of carrier proteins (bovine serum albumin, BSA; ovalbumin, OVA; keyhole limpet hemocyanin, KLH) to which haptens (fluorescein isothiocyanat, FITC; 4-hydroxy 3-nitrophenyl acetyl, NP) were coupled. Fattening pigs, sows and piglets were immunized with different hapten carrier conjugates and relative ELISA units of antigen-specific IgG, IgG1 and IgG2 were determined in the sera. For the determination of relative ELISA units, sera of immunized porkers with an intermediate reaction were selected as reference sera for all subsequent measurements.  To select a suitable carrier protein for the immunizations of sows and piglets, porker groups (n=7 per group) were immunized three times with 3 doses (3 µg, 30 µg and 300 µg) of hap-tens which were coupled to 3 different carrier proteins. Sera of animals which were immu-nized with OVA or BSA as carrier were analysed further. For all dosages a measurable immune response could be demonstrated against haptens and carrier proteins. The responses showed a maximum at day 49 after first immunization. The reaction against BSA was higher (110 ELISA units) than against OVA (74 ELISA units). The level of hapten-specific antibodies was dependent on the used carrier protein: e.g. a higher level of NP-specific antibodies and a faster rise in antibodies against FITC could be noted when OVA was used as the carrier protein. Also, the dominating isotype response de-pended on the carrier protein. Antibodies against the carrier OVA were predominantly of the IgG2 isotype. Based on the temporal course of antibody formation, the ratio between IgG2 and IgG1 among the hapten-reactive antibodies and the comparable immune response towards 30 µg and 300 µg of the hapten carrier complex, BSA (300 µg/animal) was chosen as the carrier protein for the immunization of sows and piglets. Pregnant sows (n=24, 3 groups with 8 animals each) were immunized with FITC-BSA, NP-BSA or FITC-NP-BSA four times ante partum. Serum samples were taken before or sub partu together with colostrum samples. Although individually different, antigen-specific antibodies in the sera of sows and in the colostrum samples were predominantly IgG2. Sows immunized with FITC-BSA produced more FITC-reactive antibodies (97 units IgG1, 236 units IgG2) as FITC-NP-BSA immunized animals (33 units IgG1, 65 units IgG2). The colostrum samples of the latter group however contained considerably more NP-specific antibodies (121 units IgG1, 2008 units IgG2) compared to NP-BSA immunized animals (24 units IgG1, 116 units IgG2). The piglets of 4 sows with reasonable colostrum and serum levels of antibodies against hap-tens were partly immunized with FITC-NP-OVA or only with OVA. To analyse the influence of the animal’s age, piglets were partly immunized beginning with day 7 or day 28 post natum. Early immunized animals showed up with higher hapten-specific IgG2 levels compared to IgG1 levels. In contrast, the later immunization of piglets favoured the development of hap-ten-specific IgG1. The anti-hapten response of piglets with maternal antibodies against hap-tens was considerably stronger than the response towards OVA (where no maternal antibodies were transferred via the colostrum). Piglet antibody levels against haptens reamined constant or declined by 50 % over time. However, the decline of colostrally transferred anti-BSA anti-bodies (about 90 %) was considerably higher. Hence, maternal antibodies do not generally inhibit the piglet’s own adaptive immune response. The positive role of maternal antibodies could be due to the activation of piglet B cells after antigen receptor engagement and Fc receptor engagement with antigen-bound IgG2. Whether this mechanism or the induction of anti-idiotypic and anti-anti-idiotypic antibodies partici-pates in this phenomenon could not be shown in this study. In this work, a model system has been established to investigate the carrier- and hapten-specific immune responses in pigs. This permits the characterization of the humoral immune response at the epitope and immunoglobulin isotype level. The results obtained so far demonstrate that the quality and quantity of a porcine immune re-sponse both depends on the nature of the carrier protein and of the used haptens. Moreover, they suggest a partially positive or supportive role of antigen-specific maternal antibodies for the piglets own adaptive immune response. This could be important for future vaccine devel-opments and last but not least suggests that the dogma of a nearly exclusive inhibitory and negative interfering effect of maternal antibodies should be reconsidered.

Die zunehmende Intensivierung der Schweinhaltung hat zu hohen Tierkonzentration und da-mit zwangsläufig zu günstigen Bedingungen für die Ausbreitung von Infektionskrankheiten geführt. Für die Bekämpfung vieler Schweinekrankheiten haben Impfungen einen erheblichen Stellenwert erreicht. Die gezielte Applikation eines Antigens induziert eine Immunreaktion die bei einer späteren Erregerexposition eine Infektion vermeiden oder wenigsten die klini-schen Folgen reduzieren soll. Bei der Impfung von Schweinen ergeben sich besondere Prob-leme, da sich einige Erreger verlustreicher Erkrankungen direkt nach dem Absetzen in der vierten bis zehnten Lebenswoche ausbreiten. Da zwischen der Impfung und der Bildung aus-reichend hoher Antikörperspiegel in Abhängigkeit vom Antigen zwischen zwei und vier Wo-chen vergehen können, werden in der Praxis Impfungen vermehrt während der Säugezeit durchgeführt. Da die Sauenherden mit den in der Herde vorkommenden Erregern ebenfalls infiziert sind und Antikörper über das Kolostrum an die Ferkel übertragen, haben letztere in der Regel noch maternale Antikörper gegen die Erreger, gegen die sie während der ersten Lebenswochen immunisiert werden. Die Bedeutung der Persistenz maternaler Antikörper für aktive Immunantwort der Ferkel wird kontrovers diskutiert. Die Diskussion bezieht sich dabei fast ausschließlich auf Impfversuche, bei denen die Qualität der Immunantwort aus der Menge der Serumantikörper abgeleitet wird. Grundsätzliche Er-kenntnisse zu qualitativen Effekten maternaler Antikörper auf die Ferkelimmunität und die Bedeutung der Hauptisotypen des IgG, IgG1 und IgG2, auf Mechanismen der maternal-neonatalen Immunregulation beim Schwein liegen bisher nur wenig vor. Die vorliegenden Untersuchungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, die Immunantwort nach Vakzination mit Modellantigenen qualitativ darzustellen. Die Modellantigene bestanden aus Carrierproteinen (bovines Serumalbumin, BSA; Ovalbumin, OVA; Keyhole Limpet he-mocyanin, KLH) mit daran gekoppelten Haptenen (Fluoresceinisothiocyanat, FITC; 4-hydroxy-3-Nitrophenylsäure, NP). Zur Beantwortung der Fragestellung wurden Mastschwei-ne, Sauen und Ferkel mit verschiedenen Hapten-Carrier-Konjugaten immunisiert und relative ELISA-Einheiten von IgG, IgG1 und IgG2 im Serum gemessen. Für die Bestimmung relativer ELISA-Einheiten wurden Seren immunisierter Mastschweine im mittleren Reaktionsbereich als Referenzseren für alle nachfolgenden Untersuchungen ausgewählt. Um für die Sauen- und Ferkelimmunisierungen ein passendes Carrierprotein auszuwählen wurden drei Gruppen von Mastschweinen (n=7) zunächst mit Haptenen, die an 3 verschiede-ne Carrrierproteine gekoppelt wurden, in 3 Dosisvarianten (3 µg, 30 µg und 300 µg) jeweils drei Mal immunisiert. Analysiert wurden die Gruppen die mit OVA und BSA als Carrier im-munisiert wurden. Für alle Dosierungen konnte eine messbare Immunantwort auf die Hapten-Carrier-Komplexe nachgewiesen werden. Die Immunantworten zeigten ein Maximum am 49. Tag nach der Erstimmunisierung; die IgG-Reaktion gegen BSA als Carrier fiel mit 110 relati-ven ELISA-Einheiten höher aus, als die gegen OVA mit 74 ELISA-Einheiten. Die Höhe der Antikörperspiegel gegen die gekoppelten Haptene war vom verwendeten Car-rierprotein abhängig. So zeigte sich eine höhere Antwort auf NP und ein schnellerer Anstieg von Antikörpern gegen FITC, wenn diese Haptene an OVA konjugiert waren. Die dominie-rende Isotypantwort war ebenso vom Carrierprotein abhängig. Gegen den Carrier OVA wur-den überwiegend Antikörper des Typs IgG2 gebildet. Basierend auf dem zeitlichen Verlauf der Antikörperbildung, dem Verhältnis von IgG2/IgG1-Antikörpern unter den Hapten-reaktiven Antikörpern und der vergleichbaren Immunantwort auf 30 µg und 300 µg Hapten-Carrier-Komplex, wurde für die Immunisierung von Sauen und Ferkeln das BSA (300 µg/Tier) als Carrierprotein gewählt. Tragende Sauen (n=24; drei Gruppen zu je acht Tieren) wurden mit FITC-BSA, NP-BSA oder FITC-NP-BSA zu vier Zeitpunkten ante partum immunisiert und Serumproben vor- bzw. Serum- und Kolostrumproben sub partu entnommen. Die Seren der Sauen wiesen domi-nant Hapten- und Carrier-spezifische Antikörper des Isotyps IgG2 auf. Ebenso dominierten in den Kolostren, bei individuellen Unterschieden, Antigen-spezifische IgG2-Antikörper. Die mit FITC-BSA-immunisierten Sauen bildeten am Tag 49. p. vacc. mehr Antikörper gegen FITC (97 Einheiten IgG1, 236 Einheiten IgG2) als die FITC-NP-BSA-immunisierten Sauen (33 Einheiten IgG1, 65 Einheiten IgG2). Im Kolostrum wies letztere Gruppe aber deutlich mehr Antikörper gegen NP auf (121 Einheiten IgG1, 2008 Einheiten IgG2) als die Gruppe der NP-BSA-immunisierten Tiere (24 Einheiten IgG1, 116 Einheiten IgG2). Die Ferkel von 4 Sauen mit deutlichen Kolostrum- und Serum-Antikörpergehalten wurden je zur Hälfte eines Wurfes einer Immunisierungsgruppe zugeteilt, die mit FITC-NP-OVA oder nur mit OVA immunisiert wurden. Um Einflüsse des Alters der Tiere festzustellen wurden die Ferkel teils ab dem Tag 7 post natum, teils ab dem Tag 28 post natum immunisiert. Früh immunisierte Tiere zeigten höhere IgG2- als IgG1-Antikörpergehalte gegen die Haptene. Bei spät immunisierten Ferkeln lag das Verhältnis zugunsten von IgG1-Antikörpern. Die Anti-Hapten-Antwort der Ferkel (von Sauen mit maternalen Antikörpern gegen das oder die Haptene) war deutlich stärker als die Antwort gegen ein Carrierprotein (OVA) gegen das keinen maternalen Antikörper über das Kolostrum übertragen wurden. Die Anti-Hapten-Antikörperspiegel in den Seren der Ferkel konnten über die Zeit um etwa 50 % fallen. Der Abfall kolostral übertragener anti-BSA-Antikörpern lag mit ca. 90 % jedoch deutlich höher. Damit führen maternal übertragene Antiköper generell nicht zu einer Hemmung der Ferkel-eigenen adaptiven Immunantwort. Ob hier Immunmechanismen eine Rolle spielen, die über die duale Erkennung von Antigen und Antigen-gebundenen Antikörpern eines bestimmten Isotyps (IgG2) über Fc-Rezeptoren zur Aktivierung von B-Zellen der Ferkel führen, oder ob die Induktion von anti-idiotypischen und anti-anti-idiotypischen Antikörpern dabei eine Rolle spielte, konnte in der Arbeit nicht abschließend geklärt werden. In der Arbeit ist es gelungen ein Modell zur Untersuchung der Carrier- und Hapten-spezifischen Immunantwort bei Schweinen zu etablieren, um auf Epitopebene die Isotyp-spezifische, humorale Immunantwort zu charakterisieren. Die Ergebnisse der Arbeit belegen, das die Qualität und Quantität einer porzinen Immunant-wort sowohl von den Carrierproteinen als auch von den verwendeten Haptenen abhängt und deuten auf eine z.T. unterstützende, positive Wirkung von maternalen Antikörpern für die Induktion einer adaptiven Immunantwort bei Ferkeln hin. Dies könnte für zukünftige Vakzi-ne-Entwicklungen eine Rolle spielen und bedeutet nicht zuletzt, dass das Dogma einer nahezu ausschließlich hemmenden, interferierenden Wirkung maternaler Antikörper auf dem Impfer-folg nach Vakzinierungen neu überdacht werden sollte.

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Gellermann, Maria: Immunisierung von Muttersauen mit definierten Hapten-Carrier-Komplexen zur Prüfung des Konzeptes der Idiotyp-Vakzinierung von Ferkeln nach Kolostrumaufnahme. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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