Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effects of the Fusarium toxin deoxynivalenol (DON) on protein synthesis, immunological parameters and DON-kinetics in the pig

Goyarts, Tanja

In northern temperate regions, the contamination of cereal grains, especially wheat, in the field with the Fusarium toxin deoxynivalenol (DON) is common and can not completely be prevented. Therefore, it is likely that food and feed are always contaminated to a lesser or greater extent, indicating a potential hazard to both human and farm animal health. In particular pigs react sensitively to DON, showing overt signs of toxicity such as feed refusal, emesis and diarrhoe following exposure to high DON concentrations. But the primary economical losses in animal production are due to reduced feed intake and live weight gain caused by chronic exposure to moderate amounts of DON. Furthermore, DON is described to inhibit protein synthesis via binding at 60S subunit of eukaryotic ribosomes and to modulate immune functions. These adverse effects of DON have not been studied under practical feeding conditions in pigs thus far. In addition, the toxicokinetic activity of DON may explain the susceptibility of pigs, but up to now the bioavailability of DON from a naturally contaminated source has not been examined. Moreover, it could be suggested that DON toxicokinetics and effects may be different if pigs were exposed the first time (acutely) or over a period of ≥ 4 weeks (chronically). Therefore, the present research aimed to investigate the bioavailability and the effects of DON from wheat contaminated naturally with Fusarium in pigs from the perspective of a chronic (≥ 4 weeks) and acute (one-time) exposure. To evaluate the adverse effects on feed intake and performance of a naturally DON contaminated diet of 6 mg/kg, 48 crossbred (German Landrace x Pietrain) pigs of both sexes were divided into four groups (n = 12), fed a control or DON contaminated diet either ad libitum or restrictively over 11 weeks (26 – 100 kg live weight (LW)). The restrictive feeding regimen (the same feed intake level for all pigs) was used to separate the indirect influence of feed intake from the direct effects of DON. The voluntary feed intake and live weight gain of pigs fed the DON contaminated ad libitum was decreased by 15 and 13 %, respectively. Furthermore, the consumption of the DON contaminated diet appeared to be delayed, since one hour after feeding 85 % of the control, but only 39 % of the DON group had consumed all offered feed. However, the lower growth performance seemed mainly to be a result of the reduced feed intake level, as there were no differences in the pigs fed restrictively. Accordingly, chronic dietary DON exposure was not shown to modulate haematological and clinical-chemical parameters, indicating that these parameters were not appropriate to deduce to a DON intoxication. IgA serum concentrations of pigs were increased by 70 and 20 %, after ad libitum or restrictive feeding of the DON contaminated diet, respectively. It has to be noted that ad libitum DON fed barrows consumed more of the DON contaminated diet and showed higher serum IgA levels compared to their female counterparts, indicating that only higher DON intake may influence serum IgA concentrations in pigs. DON affects the digestibility of nutrients rather inconsistently. In the first experiment digestibility of organic matter, crude protein, crude fat, and crude fibre, as well as the metabolizable energy and the nitrogen-balance of the Fusarium contaminated diet were significantly increased. On the other hand, the digestibility of crude fat was significantly decreased in a second balance study. In castrated male pigs (41.5 ± 2.0 kg LW), dietary DON from naturally contaminated wheat appeared to be rapidly and nearly completely absorbed after chronic (≥ 4 weeks, n = 5) and acute (once, n = 6) exposure, resulting in a mean bioavailability of 89 and 54 % for free DON, and of 112 and 92 % for total (conjugated + free) DON, respectively. Following chronic or acute oral DON exposure maximal serum concentrations (Cmax) of 21.2 and 15.2 ng/ml free DON were detected after (tmax) 88.4 and 99.1 min, which declined slowly thereafter with an elimination half-life (t1/2β) of 6.3 and 5.3 h. While DON kinetics after oral DON exposure followed the Bateman function, serum DON concentrations decreased biphasically after intravenous application (n = 5) of 53 μg/kg LW pure DON with a t1/2β of 15.2 h. In addition, the apparent volume of distribution of DON was higher than the total body water. No remarkable DON concentrations could be detected in serum of pigs 24 hours after oral or intravenous DON exposure. Dietary DON caused a significant increase in DON excretion with urine and faeces, whereby 50 % of the ingested DON were excreted via urine and only 2.5 % via the faeces. Furthermore, it was shown that only some pigs, which received the DON diet longer than 4 weeks, had the ability to detoxify DON to its metabolite de-epoxy-DON. When pigs had the de-epoxidation ability, de-epoxy-DON was excreted only to limited extent in the urine (8.5 %), but as a main substance in faeces (88.2 %). However, it has to be noted that de-epoxy-DON contributes only to a low extent (< 2 %) to the total recovery of 54 %, based on the urinary and faecal excretion of DON and de-epoxy-DON. Therefore, it can be assumed that de-epoxidation of DON occurs predominantly through adapted microbes in the large intestine, where unlikely systemic absorption proceeds, and will not result in a substantial detoxification for the animal.    The adverse effects of DON on the proliferation of ConA-stimulated porcine peripheral blood lymphocytes as well as immunoglobulin (IgA, IgG and IgM) concentrations was studied after adding 70 to 560 ng pure DON per ml medium in vitro using two different assays (BrdU incorporation and MTT cleavage). The proliferation was inhibited by 50 % (IC50) at 200 and 309 ng DON/ml for the BrdU and MTT assay, respectively. IgA, IgM and IgG concentrations of lymphocyte culture supernatant were inhibited by 50 % at 121, 84 and 72 ng DON/ml, respectively, indicating that porcine lymphocytes exposed to DON first decreased the production of secretory proteins (Ig´s) and thereafter their proliferation (DNA synthesis, BrdU assay)  to maintain their metabolic requirements (metabolic activity, MTT assay). After feeding a DON contaminated diet of 5.7 mg/kg to barrows either chronically (n = 13) or acutely (n = 12) ex vivo lymphocyte proliferation tended to decrease compared to the control (n = 11), but the reduction was only significant in the case of acute exposure of pigs in the MTT assay. Serum IgA concentrations of pigs were not different between the groups, whereas IgM and IgG values were significantly increased in the DON acute group, suggesting that pigs exposed for the first time (acutely) to a DON contaminated diet showed a more pronounced response in the immunological parameters, although the serum DON concentration one hour after the meal were lower compared to chronically DON fed pigs. The effect of DON on the protein synthesis of castrated male pigs of about 40 kg LW was measured using a flooding dose of the stable isotope L-[2H5]phenylalanine. The pigs were fed either a control (n = 7) or DON contaminated diet of 5.7 mg/kg chronically (n = 10) and acutely (n = 7) or were intravenously dosed with 53 μg DON/kg LW (n = 7). Plasma concentrations of total protein, albumin, fibrinogen and clinical-chemical parameters showed no difference between the groups, while protein synthesis appeared to be inhibited in lymphocytes and albumin, whereas fibrinogen synthesis was not affected. The fractional synthesis rates (FSR, %/d), meaning the percentage of protein renewed per day, were decreased by 32, 45 and 26 % for plasma albumin and by 27, 19 and 24 % for peripheral blood lymphocytes after chronic or acute oral and intravenous DON exposure, respectively. In conclusion, DON was shown to affect the performance of growing pigs mainly by reduction of feed intake. Clinical-chemical and haematological parameters seemed not to be appropriate to deduce a DON exposure. Dietary DON of 5.7 mg/kg inhibited in vivo synthesis of albumin by 40 %, whereas fibrinogen synthesis was characterized by a high intra-individual variation, but unaffected by DON. Furthermore, dietary DON appeared to disturb the immunologic function in pigs. So, lymphocyte proliferation (ex vivo) and lymphocyte protein synthesis (in vivo) was decreased by 20 and 25 %, respectively. Moreover, immunoglobulins were affected in vitro and in vivo by DON, whereby the influence of sex, feeding regimen and acute or chronic dietary DON exposure needs to be further clarified.

Die Kontamination von Getreide, insbesondere Weizen, mit dem Fusarium Toxin Deoxynivalenol (DON) auf dem Feld ist in nördlich gemäßigten Regionen häufig und kann nicht vollständig verhindert werden. Daher ist es wahrscheinlich, dass Nahrung und Futter immer zu einem geringeren oder größeren Anteil kontaminiert sind, und damit von einer potentiellen Gesundheitsgefährdung von Mensch und Tier auszugehen ist. Insbesondere Schweine reagieren empfindlich gegenüber DON, mit Vergiftungserscheinungen wie Futterverweigerung, Erbrechen und Diarrhoe nach einer Belastung mit hohen DON-Konzentrationen. Die primären ökonomischen Verluste in der Tierproduktion werden jedoch durch eine chronische Exposition mit moderaten DON-Gehalten verursacht, die durch eine reduzierte Futteraufnahme und Lebendmassezunahme gekennzeichnet sind. Weiterhin wird DON die Fähigkeit zur Hemmung der Proteinsynthese durch die Bindung an die 60S Untereinheit der Ribosomen und zur Modulation von immunologischen Funktionen zugeschrieben. Bisher sind diese negativen Auswirkungen von DON jedoch noch nicht unter praktischen Fütterungsbedingungen an Schweinen erforscht worden. Zusätzlich könnte die Toxikokinetik von DON Aufschluss über die Anfälligkeit von Schweinen geben, aber bislang ist die Bioverfügbarkeit von DON aus einer natürlich kontaminierten Quelle nicht untersucht worden. Außerdem kann vermutet werden, dass die Toxikokinetik und Auswirkungen von DON unterschiedlich sind, wenn Schweine zum ersten Mal (akut) oder über einen Zeitraum von mehr als 4 Wochen (chronisch) mit DON in Kontakt kommen. Deswegen beabsichtigte die vorliegende Arbeit, die Bioverfügbarkeit und die Auswirkungen von DON aus natürlich mit Fusarium kontaminiertem Weizen in Schweinen im Hinblick auf eine chronische (≥ 4 Wochen) oder akute (einmalige) Exposition zu untersuchen. Um die nachteiligen Auswirkungen auf die Futteraufnahme und Leistung einer natürlich mit DON kontaminierten Fütterung von 6 mg/kg zu evaluieren, wurden 48 Schweine einer Zweirassenkreuzung (Deutsche Landrasse x Pietrain) beiderlei Geschlechtes in vier Gruppen (n = 12) eingeteilt, die ein Kontroll- oder ein DON kontaminiertes Futter entweder zur ad libitum Aufnahme oder restriktiv zugeteilt über 11 Wochen (26 – 100 kg Lebendmasse (LM)) erhielten. Das restriktive Fütterungsregime (mit demselben Futteraufnahme-Niveau für alle Schweine) wurde verwendet, um die indirekten Einflüsse der Futteraufnahme von den direkten DON-Auswirkungen differenzieren zu können. Die freiwillige Futteraufnahme und die Lebendmassezunahme der Schweine, denen das DON kontaminierte Futter ad libitum verabreicht wurde, war um jeweils 15 und 13 % vermindert. Außerdem erschien der Verzehr des DON kontaminierten Futters verzögert, da eine Stunde nach der Fütterung 85 % der Kontrolle, aber nur 39 % der DON-Gruppe das gesamte angebotene Futter aufgenommen hatte. Die geringere Wachstumsleistung schien jedoch vor allen Dingen eine Folge der verringerten Futteraufnahme zu sein, da es keine Unterschiede zwischen den restriktiv gefütterten Schweinen gab. Weiterhin zeigte eine chronische DON-Belastung über das Futter keine Veränderung der hämatologischen und klinisch-chemischen Parameter, so dass diese Parameter nicht geeignet zu sein scheinen, um auf eine DON-Intoxikation zurückschließen zu können. Die IgA Serum-Konzentrationen der Schweine waren um 70 bzw. 20 % nach einer ad libitum oder restriktiven DON-Fütterung erhöht. Es sollte beachtet werden, dass ad libitum DON gefütterte Börge nicht nur mehr von dem DON kontaminiertem Futter verzehrt haben, sondern auch höhere Serum-IgA-Spiegel als die weiblichen Tiere aufwiesen, so dass vermutlich erst eine höhere DON-Aufnahme die Serum-IgA-Konzentrationen in Schweinen verändert. Der Einfluß von DON auf die Verdaulichkeit der Nährstoffe ist relativ uneinheitlich. Während die Verdaulichkeit der organischen Masse, des Rohproteins, des Rohfettes und der Rohfaser sowie die metabolisierbare Energie und die Stickstoff-Bilanz im ersten Experiment signifikant erhöht war, war die Verdaulichkeit des Rohfettes in einer zweiten Bilanz-Studie signifikant erniedrigt.   In kastrierten, männlichen Schweinen (41,5 ± 2,0 kg LM) zeigte DON aus natürlich kontaminiertem Weizen nach chronischer (≥ 4 Wochen, n = 5) und akuter (einmalig, n = 6) Aufnahme eine schnelle und fast vollständige Absorption mit einer mittleren Bioverfügbarkeit von 89 und 54 % für freies DON sowie von 112 und 92 % für Gesamt-DON (konjugiert + frei). Nach chronischer oder akuter oraler DON-Belastung wurden maximale Serumkonzentrationen (Cmax) von 21,2 und 15,2 ng/ml freies DON nach (tmax) 88,4 und 99,1 min gemessen, die danach langsamer mit einer Eliminations-Halbwertszeit (t1/2β) von 6,3 und 5,3 h absanken. Während die DON-Kinetik nach oraler Exposition der Bateman-Funktion folgte, verringerte sich die DON-Konzentration nach intravenöser Verabreichung (n = 5) von 53 μg/kg LM reinem DON biphasisch mit einer t1/2β von 15,2 h. Dabei war das scheinbare Verteilungsvolumen höher als das Gesamt-Körperwasser. Vierundzwanzig Stunden nach oraler oder intravenöser DON-Exposition konnten keine nennenswerten DON-Konzentrationen im Serum der Schweine nachgewiesen werden. Die DON-Fütterung verursachte eine signifikante Erhöhung der DON-Exkretion mit Urin und Fäzes, wobei 50 % des aufgenommen DON mit dem Urin und nur 2,5 % mit dem Kot ausgeschieden wurden. Ferner zeigte sich, dass lediglich wenige Schweine, die das DON kontaminierte Futter länger als 4 Wochen erhielten, die Fähigkeit zur Detoxifizierung von DON zu seinem Metaboliten de-epoxy-DON aufwiesen. Schweine, die die Fähigkeit zur De-epoxidierung hatten, schieden de-epoxy-DON nur zu geringen Anteilen mit dem Harn (8,5 %), sondern vornehmlich über den Kot (88,2 %) aus. Allerdings sollte beachtet werden, dass de-epoxy-DON lediglich einen geringen Teil (< 2 %) der Gesamt-Wiederfindung von 54 % ausmacht, die auf der Urin- und Kotausscheidung von DON und de-epoxy-DON basiert. Deswegen kann angenommen werden, dass die De-epoxidierung von DON durch adaptierte Mikroben insbesondere im Dickdarm vorkommt, in dem kaum eine systemische Absorption stattfindet, und somit nicht zu einer substantiellen Detoxifizierung für das Tier beiträgt. Die nachteiligen Auswirkungen von DON auf die Proliferation von ConA-stimulierten porcinen, peripheren Blut-Lymphozyten sowie auf die Immunglobulin- (IgA, IgG und IgM) Konzentrationen wurde in vitro nach Zugabe von 70 bis 560 ng reinem DON pro ml Medium mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Tests (BrdU-Einbau und MTT-Spaltung) untersucht. Die Proliferation wurde bei 200 und 309 ng DON/ml im BrdU und MTT assay zu 50 % gehemmt (IC50). Die IgA-, IgM- und IgG-Konzentrationen im Überstand der Lymphozytenkultur wurde bei jeweils 121, 84 und 72 ng DON/ml zu 50 % inhibiert, so dass davon ausgegangen werden kann, dass DON-exponierte Schweine-Lymphozyten zuerst die Produktion von sekretorischen Proteinen (Ig´s) und danach ihre Vermehrung (DNA-Synthese, BrdU assay) einstellen, um ihren Erhaltungsbedarf für den Stoffwechsel aufrechterhalten zu können (metabolische Aktivität, MTT assay). Nach chronischer (n = 13) oder akuter (n = 12) Verfütterung eines DON kontaminierten Futters von 5,7 mg/kg an Börge, zeigte sich eine Tendenz zu einer verringerten ex vivo Lymphozyten-Proliferation im Vergleich zur Kontrolle (n = 11), die jedoch nur in akut DON-exponierten Schweinen im MTT assay Signifikanz erreichte. Zwischen den Gruppen gab es keinen Unterschied in den Serum-IgA-Konzentrationen der Schweine, während die IgM- und IgG-Werte in der akuten DON-Gruppe signifikant erhöht waren. So kann vermutet werden, dass Schweine, die zum ersten Mal (akut) Kontakt zu einem DON kontaminiertem Futter haben, eine ausgeprägtere Reaktion der immunologischen Parameter aufweisen, obwohl die Serum-DON-Konzentration eine Stunde nach der Mahlzeit geringer sind als bei den chronisch mit DON gefütterten Schweinen. Der Effekt von DON auf die Proteinsynthese von kastrierten, männlichen Schweinen mit etwa 40 kg LM wurde mittels einer “flooding dose” des Stabil-Isotopes [2H5]Phenylalanin gemessen. Den Schweinen wurde entweder ein Kontroll- (n = 7) oder ein DON kontaminiertes Futter von 5,7 mg/kg chronisch (n = 10) und akut (n = 7) verabreicht oder sie erhielten eine Dosis von 53 μg DON/kg LM intravenös (n = 7). Die Plasma-Konzentrationen von Gesamtprotein, Albumin, Fibrinogen und den klinisch-chemischen Parametern wiesen keine Unterschiede zwischen den Gruppen auf, während die Proteinsynthese der Lymphozyten und des Albumins gehemmt, die Fibrinogen-Synthese jedoch unbeeinflusst erschien. Die fraktionellen Syntheseraten (FSR, %/d), d.h. der Prozentsatz an neu synthetisiertem Protein pro Tag, von Albumin waren um je 32, 45 und 26 % und von den peripheren Blut-Lymphozyten um je 27, 19 und 24 % nach einer chronisch oder akut oralen und intravenösen DON-Belastung verringert. Somit kann geschlussfolgert werden, dass DON die Leistung von Mastschweinen hauptsächlich durch eine Reduktion der Futteraufnahme beeinflusst hat. Klinisch-chemische und hämatologische Parameter sind anscheinend nicht geeignet, um auf eine DON-Belastung zurückzuschließen. Futter mit einem DON-Gehalt von 5,7 mg/kg hemmte die in vivo Synthese von Albumin um etwa 40 %, während die Fibrinogen-Synthese durch eine hohe intra-individuelle Variation gekennzeichnet, aber nicht durch DON beeinflusst war. Außerdem schien aus Futter stammendes DON immunologische Funktionen in Schweinen zu beeinträchtigen. So waren die Lymphozyten-Proliferation (ex vivo) sowie die Lymphozyten-Proteinsynthese (in vivo) um 20 bzw. 25 % vermindert. Darüber hinaus waren die Immunglobuline in vitro und in vivo durch DON beeinflusst, wobei der Einfluss des Geschlechtes, des Fütterungsregimes und der akuten oder chronischen DON-Belastung noch weiter aufgeklärt werden sollte.



Goyarts, Tanja: Effects of the Fusarium toxin deoxynivalenol (DON) on protein synthesis, immunological parameters and DON-kinetics in the pig. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.


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