Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der [alpha]- und [beta]-Tubulin-Gene von Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora unter Berücksichtigung von mit Benzimidazol-Resistenz assoziierten Allelen

Heyden, Vera Claudine

Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora are the major causes of parasitic gastroenteritis in cattle, which is of great economic importance. For anthelmintic treatment benzimidazoles (BZ) and macrocyclic lactones have been widely used for a long time. Resistance against these drugs are widespread in trichostrongyles of small ruminants and are as well of increasing importance in cattle nematodes. BZ inhibit microtubule poly­merization by binding to parasitic β-tubulin (βT) molecules. Numerous investigations have shown benzimidazole resistance in gastrointestinal strongyles of sheep and horses to be correlated with single nucleotide polymorphisms in position 167 and/or 200 of βT of either isotype 1 (βT1) and/or 2 (βT2). The aim of this study was to provide a basis for further investigation of BZ resistance associated alleles in C. oncophora and O. Ostertagi. Complete cDNA sequences from C. oncophora and O. ostertagi were amplified, cloned and sequenced, representing three different tubulin genes of each species: α-tubulin (αT), βT1 und βT2. Sequence alignments of the αT cDNAs showed 71-86 % identity to αT genes from other organisms. However, they showed only 49-50 % identity with βT1 or βT2 genes of the same or other species of trichostrongyles. Comparisons of the βT cDNAs showed identities of 89-93 % for βT1-βT1, 85-87 % for βT2-βT2, while comparisons between βT1 and βT2 sequences within the same species only showed 76-79 % identities. In addition to the cDNA sequences the genomic sequences flanking positions 167 and 200 of βT1 were characterized for both C. oncophora and O. ostertagi. Unfortunately populations of either C. oncophora or O. ostertagi with full BZ resistance were not available. Therefore BZ sensitive O. ostertagi were selected by four passages in vivo with sub-therapeutic doses of albendazole (with 15 %, 20 %, 22 % and 20 % of the recommended dose, respectively). The increasingly BZ selected subpopulations of O. ostertagi showed a tendency towards increasing effective doses in the egg hatch assay with BZ. Following the fourth selection, the effective doses of BZ were significantly higher (p<0.05) than those of the original population. Up to the fourth selection step, all populations showed a BZ sensitive status in the egg count reduction test. The sub-population after the fourth selection was not tested in vivo. Initially two populations of C. oncophora were available, one sensitive and one ivermectin resistant. The latter was once further selected by treatment of experimentally infected calves with 0.2 mg ivermectin/kg body weight. This additionally selected subpopulation was analyzed separately. All three isolates of C. oncophora gave BZ sensitive results in the egg count reduction test. With increasing level of ivermectin resistance these populations also showed increasing effective doses for BZ in vitro (p<0.01), comparing the sensitive and the most ivermectin-selected population. This might point at shared mechanisms of resistance against BZ and ivermectin. A method for quantitative determination of allele frequencies and genotypes in the BZ resistance associated positions 167 and 200 of βT using PyrosequencingTM technology was established by analyzing samples with known allele frequencies. The results showed a highly significant correlation to the actual values. Using this method, 109 (C. oncophora)/107 (O. ostertagi) single adult males were analyzed in both positions. All of them were genotyped homozygous for phenylalanine. Likewise, pooled third stage larvae of all isolates were analyzed in both positions. Although the subpopulations of O. ostertagi showed higher effective doses of BZ in vitro with increasing level of BZ selection they did not show any significant changes in allele frequencies. It has to be assumed that the level of selection achieved thus far is too minor to result in marked changes of the genotype of the respective populations. Therefore, based on these results, it is not possible to come to a conclusion regarding the importance of the mutations in positions 167 or 200 in the development of BZ resistance. The successfully completed characterization of the O. ostertagi and C  oncophora tubulin genes, as well as the development of the PyrosequencingTM-based method for the analysis of resistance-related alleles, are prerequisites for the further investigation of the BZ resistance mechanism in these species.

Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora sind die wichtigsten Erreger der wirtschaftlich bedeutsamen parasitären Gastroenteritis des Rindes. Zur Bekämpfung werden seit langem Benzimidazole (BZ) oder makrozyklische Laktone eingesetzt. BZ binden an die β-Tubulin (βT)-Moleküle der Parasiten und inhibieren dadurch die Mikrotubuli-Synthese. Resistenzen gegen diese Wirkstoffe sind bei Magen-Darm-Strongyliden von kleinen Wieder­käuern und Pferden bereits weit verbreitet und nehmen auch bei Rinder-Nematoden zu. Zahlreiche Untersuchungen haben dort Zusammenhänge zwischen phänotypischer BZ-Resistenz und Punktmutationen in den Coda 167 und/oder 200 des βT-Gens vom Isotyp 1 (βT1) bzw. 2 (βT2) gezeigt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Grundlage für die Erforschung von mit BZ-Resistenz assoziierten Allelen bei C. oncophora und O. ostertagi zu schaffen. Aus BZ-sensiblen Populationen von C. oncophora bzw. O. ostertagi wurden vollständige cDNA-Sequenzen je dreier verschiedener Tubulin-Gene amplifiziert, kloniert und sequenziert: α-Tubulin (αT), βT1 und βT2. Im Sequenzvergleich zeigten die αT-Gene 71-86 % Übereinstimmung mit αT-Genen anderer Nematoden, hingegen nur 49-50 % mit den βT-Genen derselben Spezies. Die βT1-Gene stimmten im interspezifischen Vergleich zu 89-93 % überein, die βT2-Gene zu 85-87 %. Vergleiche der beiden βT-Isotypen innerhalb einer Spezies ergaben dagegen nur 76-79 % Ähnlichkeit. Zusätzlich wurden die genomischen Sequenzen des βT1-Gens im Bereich der Coda 167 und 200 von C. oncophora und O. ostertagi charakterisiert. Vollständig BZ-resistente Populationen standen von keiner der beiden Arten zur Verfügung. Um Hinweise auf mögliche Resistenz-Mechanismen zu gewinnen, wurde daher eine BZ-sensible Population von O. ostertagi in vier Passagen in vivo mit subtherapeutischen Dosie­rungen von Albendazol (15 %, 20 %, 22 % und nochmals 20 % der empfohlenen therapeu­tischen Dosis) selektiert. Die zunehmend selektierten Subpopulationen zeigten im Larven­schlupfhemmtest mit BZ eine steigende Tendenz der effektiven Dosis. Diese unterschied sich nach der vierten Selektion statistisch signifikant von den ermittelten Werten der Ausgangspopulation (p<0.05). Bis nach der dritten Selektion reagierten alle Populationen im Eizahlreduktionstest BZ-sensibel. Die viermal selektierten O. ostertagi wurden mittels dieses Testes nicht untersucht. Von C. oncophora standen je eine sensible und eine Ivermectin-resistente Population zur Verfügung. Letztere wurde zusätzlich mit 0,2 mg Ivermectin/kg Körpergewicht selektiert und separat weiter untersucht. Alle drei Isolate reagierten im Eizahlreduktionstest BZ-sensibel. Mit zunehmendem Grad der Ivermectin-Resistenz der Isolate sank die Effizienz der BZ-Wirkung in vitro (p<0.01) im Vergleich der sensiblen mit der am stärksten Ivermectin-selektierten Population von C. oncophora. Dies weist eventuell auf das Vorliegen gemeinsamer Resistenz-Mechanismen gegen BZ und Ivermectin hin. Eine Untersuchungsmethode zur quantitativen Bestimmung der Allelfrequenz der BZ-Resistenz-assoziierten Coda 167 und 200 des βT-Gens mittels PyrosequencingTM-Techno­logie wurde zunächst an Proben mit definierten Allelfrequenzen etabliert. Das Verfahren ergab höchst signifikante Übereinstimmungen zwischen tatsächlichen und gemessenen Genotypen bzw. Allelfrequenzen. Mit dieser Methode wurden 109 bzw. 107 adulte Männchen der BZ-sensiblen Isolate von C. oncophora und O. ostertagi einzeln in beiden Coda geno­typisiert. Dabei wurden durchweg homozygote Phenylalanin-Allele festgestellt. Auch Pools dritter Larven aller Isolate wurden hinsichtlich der Allelfrequenzen beider Coda untersucht. Trotz signifikanter, mit wiederholter BZ-Selektion von O. ostertagi einhergehender, Unter­schiede in der effektiven Dosis von BZ in vitro, konnten keine signifikanten Allelfrequenz-Änderungen in den Coda 167 oder 200 nachgewiesen werden. Es ist zu vermuten, dass der bisher erreichte Selektionsgrad noch zu geringfügig ist, um eindeutige genotypische Veränderungen in den untersuchten Populationen zu bewirken. Insofern lassen die hier gewonnenen Ergebnisse noch keinen Schluss auf eine Bedeutung der untersuchten Allele im BZ-Resistenz-Geschehen zu. Die Charakterisierung der Tubulin-Gene von C. oncophora und O. ostertagi, sowie das neu entwickelte molekulare Verfahren zur Untersuchung BZ-Resistenz-assoziierter Allele bilden die Grundlage für zukünftige Analysen des BZ-Resistenz-Mechanismus dieser Spezies.

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Heyden, Vera Claudine: Charakterisierung der [alpha]- und [beta]-Tubulin-Gene von Ostertagia ostertagi und Cooperia oncophora unter Berücksichtigung von mit Benzimidazol-Resistenz assoziierten Allelen. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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