Rückstände in Eiern nach Anwendung von Enrofloxacin bei Legehennen in Boden- und Käfighaltung

Jürgens, Wolfram

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Rückstände in Eiern nach Anwendung von Enrofloxacin bei Legehennen in Boden- und Käfighaltung

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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, für Enrofloxacin und seinen Hauptmetaboliten Ciprofloxacin Ausscheidungskurven aus Hühnereiern nach Einsatz von Baytril® - Orale Lösung in verschiedenen Dosierungen bei Legehennen in unterschiedlichen Haltungsformen zu erarbeiten. Enrofloxacin ist für die Anwendung bei Legehennen zwar nicht zugelassen, kann aber im Falle eines Therapienotstandes zum Einsatz kommen, wobei eine pauschale Wartezeit von 10 Tagen einzuhalten ist. Hierzu musste eine sensitive HPLC-Methode entwickelt werden. Ferner sollte festgestellt werden, ob sich neben der HPLC ein routinemäßig durchführbarer und weniger kosten- und zeitintensiver Labortest wie der Agardiffusionstest zum Nachweis von Fluorchinolonrückständen in Hühnereiern eignet und ob und inwieweit die Ergebnisse beider Analyseverfahren miteinander korrelieren. Zu diesem Zweck wurden zwei Gruppen von Hühnern in Käfigen und eine weitere in Bodenhaltung aufgestallt und über einen Zeitraum von 3 – 5 Tagen mit unterschiedlichen Dosierungen von Baytril® - Orale Lösung über das Trinkwasser behandelt. Die Eier wurden vom ersten Behandlungstag an für die folgenden 40 Tage gesammelt, Eidotter und Eiklar getrennt und mittels Festphasenextraktion über eine SA-Säule aufgereinigt. Die Analyse erfolgte dann mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion sowie in einem Agardiffusionstest. Die Nachweisgrenzen der HPLC lagen für Enrofloxacin bei 0,02 µg/kg Vollei, für Ciprofloxacin bei 0,04 µg/kg Vollei. Sowohl in Käfig- als auch in Bodenhaltung lagen die festgestellten Rückstände in Eiklar höher als in Eidotter, wobei jeweils Enrofloxacin trendmäßig in höheren Konzentrationen nachweisbar war als Ciprofloxacin. Enrofloxacin konnte erstmalig bereits 24 Stunden nach Behandlungsbeginn, Ciprofloxacin dagegen um 1 – 2 Tage zeitversetzt nachgewiesen werden. Hohe Konzentrationen konnten für beide Wirkstoffe ab dem 3. Tag nach ihrem ersten Auftreten ermittelt werden und hielten sich für etwa 4 – 8 Tage auf diesem hohen Niveau. Die Maximalwerte lagen in Versuchsansatz 1 für Enrofloxacin beispielsweise bei 1.626,26 µg/kg Vollei und für Ciprofloxacin bei 243,40 µg/kg Vollei; in Versuchsansatz 2 bei 3.217,99 µg/kg Vollei bzw. bei 311,11 µg/kg Vollei und für Versuchsansatz 3 bei 11.880,56 µg/kg Vollei bzw. bei 347,48 µg/kg Vollei. In den Käfighaltungen, bei denen lediglich die Applikation des Medikaments in unterschiedlicher Dosierung erfolgte, die Haltungsform ansonsten aber gleich war, waren sowohl die ermittelten maximalen Rückstände als auch die Dauer der Ausscheidung vergleichbar. Dabei erfolgte die Elimination der Stoffe aus dem Eiklar schneller als aus dem Eidotter. Rückstände waren bis zum 34. bzw. bis zum 36. Tag nach Behandlungsende nachweisbar. Bei Eiern aus Bodenhaltung waren trendmäßig insgesamt höhere Konzentrationen für Enro- und Ciprofloxacin und über einen längeren Zeitraum als in den Käfiggruppen feststellbar. Die Elimination nahm dementsprechend mehr Zeit in Anspruch, wobei Rückstände bis zum letzten Beobachtungstag nachgewiesen werden konnten. Die absoluten Konzentrationen und das Eliminationsverhalten von Enro- und Ciprofloxacin waren außerdem weitgehend unabhängig von der individuellen Legetätigkeit. Hühner, die erst nach Behandlungsende wieder Eier legten, zeigten lediglich eine niedrigere Wirkstoffkonzentration in Eiklar. Aufgrund der vorliegenden Untersuchungen kann festgestellt werden, dass eine zehntägige Wartezeit für Enrofloxacin nach Anwendung bei Legehennen unabhängig von Dosierung und Haltungsform auf keinen Fall ausreichend ist, um eine Rückstandsfreiheit der Eier zu gewährleisten. Die Ergebnisse des Agardiffusionstests korrelierten hochsignifikant mit denen der HPLC, wobei jedoch die Nachweisgrenzen auf E.coli Platten mit 2,89 µg/kg Vollei und auf Bac. subtilis Platten mit 3,02 µg/kg Vollei deutlich höher lagen. Mit dem Agardiffusionstest steht ein ausreichend sensitives, routinemäßig durchführbares Screening-Verfahren zum Nachweis von Enro- und Ciprofloxacinrückständen in Hühnereiern zur Verfügung.

Aim of this thesis was to elaborate depletion curves for Enrofloxacin and its main metabolite Ciprofloxacin in eggs after oral administration of different doses of Baytril® - Orale Lösung via drinking water in laying hens held in cages and in ground posture. There is no license for the use of Enrofloxacin in laying hens in Germany except for cases of urgent lack of suitable authorised alternatives when extra label use is allowed, which is followed by a general withdrawal treatment period of 10 days that must be hold on to. Therefore, the development of a sensitive method of HPLC is required. Furthermore, it should be checked whether an agar diffusion microbiological assay of low cost and short preparation time needed can be regularly used to detect residues in eggs and whether the results obtained by both methods are comparable. Two groups of laying hens held in cages and one group held in ground posture were administered different doses of the drug for 3 to 5 days. From the first day of treatment on, the eggs were collected daily for 40 days. Yolk and white were separated, cleaned-up via a SA-column and analyzed both by HPLC combined with fluorescent detection and by the microbiological assay. The limits of detection of the HPLC method were 0,02 µg/kg full egg for Enrofloxacin and 0,04 µg/kg full egg for Ciprofloxacin. For all three groups, the residues found in egg white were tendenciously higher than those in yolk while Enrofloxacin was always present in larger amounts than Ciprofloxacin. 24 hours after starting the administration of the drug, the first traces of Enrofloxacin were observed while Ciprofloxacin was initially detected about 1 to 2 days later. From day 3 after the initial observation on, high amounts of both substances were determined and stayed on high levels for 4 to 8 days approximately. In cage 1, the highest residues detected were 1.626,26 µg Enrofloxacin/kg full egg and 243,40 µg Ciprofloxacin/kg full egg respectively; in cage 2 3.217,99 µg Enrofloxacin/kg full egg and 311,11 µg Ciprofloxacin/kg full egg, and for hens held in ground posture, 11.880,56 µg Enrofloxacin/kg full egg and 347,48 µg Ciprofloxacin/kg full egg. In the 2 groups held in cages, which differed only by the administered dose of drug, both maximum residues and necessary elimination time were comparable. The depletion period in white was shorter than in yolk, but in both cases, residues were observed for 34 and for 36 days post-administration respectively. In the group held in ground posture, residues were found in significantly higher amounts and over a longer period of time compared to the other groups. Accordingly, depletion took comparably longer until the end of observation. The absolute concentration and elimination of Enro- and Ciprofloxacin was independent from the individual frequency of laying eggs. Hens starting to lay not before the end of administration only showed a lower concentration of both substances in egg white. Based on the present study, it can be declared that a 10 days’ withdrawal period after the application of enrofloxacin in laying hens is definitely not sufficient to ensure the absence of residues no matter which dose or posture form was chosen. The results of the agar diffusion microbiological assay showed significant correlations to those obtained by HPLC, while the limits of detection were clearly higher: on plates using E.coli 2,89 µg/kg full egg and on plates using Bac. subtilis 3,02 µg/kg full egg. Therefore, the agar diffusion microbiological assay represents a satisfactorily sensitive and easily working screening-method to detect residues of Enro- and Ciprofloxacin.