Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleich verschiedener Aufbereitungsverfahren zur Kryokonservierung von Hengstejakulaten

Knop, Katharina Anne

In order to improve the processing of semen prior to freezing, five experiments were conducted to evaluate damage occuring in each processing step. In experiment 1 increasing gravitational force and prolonged centrifugation time of up to 1000 x g for 20 min achieved either by cushioned technique (Cushion-fluidÒ) or use of siliconized glass tube resulted in a more efficient processing of stallion semen for freezing with respect to sperm recovery (83%, 92%) when compared to routine methods recommended for centrifugation of stallion semen (600 x g,10min; 75%) (p<0,05). After thawing, neither high speed nor prolonged time of centrifugation showed detrimental effects on motility, membrane integrity, acrosomal status and mitochondrial membrane potential of spermatozoa in ejaculates with good and poor freezability from 14 stallions (7 stallions per group x 3 ejaculates) when compared to routine centrifugation method. Experiment 2 evaluated a cushioned centrifugation technique in which various extenders were tested and compared to centrifugation up to 1000 x g for 20 min without cushion. Use of a cushion associated with a clear extender (EqcellsireÒ: EQA+2% egg yolk or Hepes-buffered saline) improved the recovery rate of spermatozoa after centrifugation (95%, 93%) when compared to the use of an opaque extender containing milk (INRA-82, 85%). When semen was centrifuged up to 1000 x g for 20 min without a cushion, detrimental effects were shown on motility, membrane integrity, acrosomal status and mitochondrial membrane potential of spermatozoa in ejaculates with good and poor freezability from 12 stallions (6 stallions per group x 3 ejaculates) when compared to cushioned centrifugation methods. Furthermore, in experiment 2 ejaculates have been centrifuged and processed as described above, cooled to 5°C and frozen with a delay of 24h. Freezing after a storage of 24h showed detrimental effects on motility, average path velocity, membrane integrity, acrosomal status and mitochondrial membrane potential of spermatozoa in ejaculates compared with the routine method of freezing after semen collection (p>0,05). In experiment 3 a method of slow cooling for semen tubes from 22°C to 5°C in a beaker filled with water was tested after centrifugation and addition of glycerol in comparison to direct freezing from 22°C. Eight stallions with known high and low ability to survive cooling were used for artificial insemination of cooled-stored-transported semen in this study (n=4 stallions per group x 3 ejaculates). Post-thaw motility, average path velocity, membrane integrity, acrosomal status and mitochondrial membrane potential of spermatozoa were significantly improved (p>0,05) by slow cooling prior to freezing for both groups of stallions. Experiment 4 evaluated spermatozoa cryopreserved at 3 different concentrations in ejaculates from 8 stallions with known good and poor freezability (n=4 stallions per group x 3 ejaculates). Post-thaw motility, average path velocity, membrane integrity, acrosomal status and mitochondrial membrane potential of spermatozoa were significantly higher at spermatozoal concentrations of 200 and 800x106/ml than for the sample frozen at 1,6x109spermatozoa/ml. However, the stallions with known poor freezability (n=4) showed a lower quality in frozen-thawed semen already at a concentration of 800x106spermatozoa/ml. In summary a suggested protocol for cryopreservation of stallion spermatozoa would include: 1) centrifugation by cushioned technique associated with a milk or an egg yolk extender at 1000 x g for 20 min; 2) slow cooling prior to freezing from 22°C to 5°C after centrifugation and addition of glycerol; 3) package in 0,5 ml straws at a concentration of 200x106spermatozoa/ml.

In der vorliegenden Arbeit wurden 5 verschiedene Aufbereitungsverfahren zur Verbesserung der Tiefgefriersamenqualität von Hengstsamen untersucht. Die Untersuchung wurde an insgesamt 34 Zuchthengsten des Landesgestütes Niedersachsen durchgeführt. Der Einfluss der jeweiligen Verfahren wurde einmal in Gesamtbetrachtung aller Hengste als auch an den einzelnen Gruppen der Hengste mit guter und schlechter Tiefgefriereignung bzw. Haltbarkeit überprüft. Die Motilität wurde mittels Computervideomikrographie (MIKA Motion Analyser), der akrosomale Status (SYTO®17 / FITC-PNA/PI-Färbung), das Mitochondrienmembranpotential (JC-1-Färbung) und die Spermienchromatinstruktur (SCSA™) wurden mittels Durchflusszytometer (FACScan™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) analysiert und als Beurteilungskriterien eingesetzt. In der Versuchsreihe I wurde die Zentrifugation mit erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) unter Verwendung einer Kissenzentrifugationstechnik (Cushionfluid®Minitüb) bzw. eines silikonisierten Zentrifugenglases (1000 x g/20min) mit einer Standardmethode (600 x g/10min) verglichen. Dies wurden an Samen von 14 Hengsten mit guter und schlechter Tiefgefriereignung überprüft (n=7; 3 Ejakulate pro Hengst). Dabei konnten höhere Rückgewinnungsraten (83%, 92%) bei hoher Zentrifugationskraft erreicht werden als bei der Standardmethode (75%) (p<0,05). Nach dem Auftauen konnte kein negativer Einfluss auf die Tiefgefriersamenqualität für Motilität, Anteil vitaler Spermien und akrosomreagierter Spermien sowie für Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential festgestellt werden. In Versuchsreihe II wurde der Einfluss verschiedener Zentrifugationsverdünner auf die Kissenzentrifugation untersucht. Dies wurde mit der Zentrifugation ohne Kissenzusatz bei erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) verglichen. Es wurden Ejakulate von 12 Hengsten verwendet, die in Gruppen mit guter und schlechter Tiefgefriereignung aufgeteilt waren (jeweils n=6; 3 Ejakulate pro Hengst). Die Rückgewinnungsrate war signifikant höher (95%, 93%) bei der Zentrifugation mit einem klaren Zentrifugationsverdünner (Lsg. A + 2% Eigelb; Eqcellsire®, IMV L`Aigle Frankreich oder Hepes-gepufferte Salslösung) als mit einem Magermilchverdünner (INRA-82, 85%). Ein signifikant positiver Einfluss auf die Motilität und auf die membranintakten Samenzellen nach Zentrifugation konnte bei Verdünnung mit Magermilch (INRA-82) und Eigelb enthaltendem Verdünner (Eqcellsire®) festgestellt werden. Die Zentrifugation mit erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) ohne Kissenzusatz zeigte im Vergleich zu der Zentrifugation mit Kissen einen schädigenden Einfluss auf die Motilität, auf den prozentualen Anteil vitaler und akrosomreagierter Spermien und auf Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (p<0,05). Die Lagerungsdauer von 24 Std. vor dem Einfrieren zeigte einen negativen Einfluss auf die Motilität, auf die Geschwindigkeitsparameter, auf den prozentualen Anteil vitaler Spermien und auf Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential im Vergleich zum Standardeinfrierverfahren nach 2,5 Std. (p<0,05). In Versuchsreihe III wurde der Einfluss einer langsamen Abkühlungsrate auf 5°C vor dem Einfrierprozess mit direktem Einfrieren nach Zentrifugieren und der Glyzerinzugabe bei 22°C auf die Qualität von Tiefgefriersperma verglichen. Dies wurde anhand von 8 Hengsten (3 Ejakulate pro Hengst) überprüft, die aufgrund ihrer Spermaqualität nach 24 Std. Lagerung bei 5°C in zwei Gruppen mit guter (n=4) und schlechter (n=4) Toleranz gegenüber dem Abkühlungsprozess und der Lagerung bei 5°C aufgeteilt worden waren. Nach langsamer Abkühlungsrate über eine Dauer von 2,5 Std. vor dem Einfrieren zeigte sich eine signifikante Überlegenheit bei der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien, bei dem prozentualen Anteil membranintakter und somit vitaler Spermien und bei den prozentualen Anteil der Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential gegenüber dem direkten Einfrierverfahren von 22°C (p≤0,05). Beim akrosomalen Status wies die direkte Einfriermethode ohne Abkühlungszeit auf 5°C einen signifikant höheren Anteil akrosomreagierter Samenzellen auf als nach einer langsamen Abkühlungszeit (p≤0,05). In Versuchsreihe IV wurde der Einfluss von drei verschiedenen Samenzellkonzentrationen in 0,5 ml-Pailletten auf die Tiefgefriersamenqualität von 8 Hengsten, aufgeteilt in Gruppen mit guter und schlechter Tiefgefriereignung (n=4, 3 Ejakulate pro Hengst), untersucht. Die aufgetauten Samenproben zeigten bei einer Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml und 800x106 Samenzellen/ml signifikant höhere Werte für die Vorwärtsbeweglichkeit, die Geschwindigkeitsparameter sowie für den prozentualen Anteil membranintakter und somit vitaler Spermien als bei einer Konzentration von 1,6x109Samenzellen/ml. Während eine Erhöhung der Konzentration auf 800x106 Samenzellen/ml bei Hengsten mit guter Tiefgefriereignung (n=4) keinen Einfluss auf die Samenqualität zeigte, erwies sich bei Hengsten mit schlechter Tiefgefriereignung (n=4) eine Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml von Vorteil. Ein nach diesen Ergebnissen vorzuschlagendes Aufbereitungsprotokoll zur Kryokonservierung von Hengstsamen beinhaltet die Zentrifugation mit Hilfe der Kissenzentrifugationstechnik für 20min bei 1000 x g, kombiniert mit einem Magermilch oder Eigelb enthaltenden Zentrifugationsverdünner, der Zugabe von Glyzerin bei 22°C nach der Zentrifugation und einer langsamen Abkühlungsrate auf 5°C über einen Zeitraum von 2,5 Std. sowie eine Konfektionierung mit einer Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml in 0,5 ml-Pailletten.

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Knop, Katharina Anne: Vergleich verschiedener Aufbereitungsverfahren zur Kryokonservierung von Hengstejakulaten. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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