Vergleich verschiedener Aufbereitungsverfahren zur Kryokonservierung von Hengstejakulaten

In der vorliegenden Arbeit wurden 5 verschiedene Aufbereitungsverfahren zur Verbesserung der Tiefgefriersamenqualität von Hengstsamen untersucht. Die Untersuchung wurde an insgesamt 34 Zuchthengsten des Landesgestütes Niedersachsen durchgeführt. Der Einfluss der jeweiligen Verfahren wurde einmal in Gesamtbetrachtung aller Hengste als auch an den einzelnen Gruppen der Hengste mit guter und schlechter Tiefgefriereignung bzw. Haltbarkeit überprüft. Die Motilität wurde mittels Computervideomikrographie (MIKA Motion Analyser), der akrosomale Status (SYTO®17 / FITC-PNA/PI-Färbung), das Mitochondrienmembranpotential (JC-1-Färbung) und die Spermienchromatinstruktur (SCSA™) wurden mittels Durchflusszytometer (FACScan™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) analysiert und als Beurteilungskriterien eingesetzt. In der Versuchsreihe I wurde die Zentrifugation mit erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) unter Verwendung einer Kissenzentrifugationstechnik (Cushionfluid®Minitüb) bzw. eines silikonisierten Zentrifugenglases (1000 x g/20min) mit einer Standardmethode (600 x g/10min) verglichen. Dies wurden an Samen von 14 Hengsten mit guter und schlechter Tiefgefriereignung überprüft (n=7; 3 Ejakulate pro Hengst). Dabei konnten höhere Rückgewinnungsraten (83%, 92%) bei hoher Zentrifugationskraft erreicht werden als bei der Standardmethode (75%) (p<0,05). Nach dem Auftauen konnte kein negativer Einfluss auf die Tiefgefriersamenqualität für Motilität, Anteil vitaler Spermien und akrosomreagierter Spermien sowie für Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential festgestellt werden. In Versuchsreihe II wurde der Einfluss verschiedener Zentrifugationsverdünner auf die Kissenzentrifugation untersucht. Dies wurde mit der Zentrifugation ohne Kissenzusatz bei erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) verglichen. Es wurden Ejakulate von 12 Hengsten verwendet, die in Gruppen mit guter und schlechter Tiefgefriereignung aufgeteilt waren (jeweils n=6; 3 Ejakulate pro Hengst). Die Rückgewinnungsrate war signifikant höher (95%, 93%) bei der Zentrifugation mit einem klaren Zentrifugationsverdünner (Lsg. A + 2% Eigelb; Eqcellsire®, IMV L`Aigle Frankreich oder Hepes-gepufferte Salslösung) als mit einem Magermilchverdünner (INRA-82, 85%). Ein signifikant positiver Einfluss auf die Motilität und auf die membranintakten Samenzellen nach Zentrifugation konnte bei Verdünnung mit Magermilch (INRA-82) und Eigelb enthaltendem Verdünner (Eqcellsire®) festgestellt werden. Die Zentrifugation mit erhöhter Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (1000 x g/20min) ohne Kissenzusatz zeigte im Vergleich zu der Zentrifugation mit Kissen einen schädigenden Einfluss auf die Motilität, auf den prozentualen Anteil vitaler und akrosomreagierter Spermien und auf Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (p<0,05). Die Lagerungsdauer von 24 Std. vor dem Einfrieren zeigte einen negativen Einfluss auf die Motilität, auf die Geschwindigkeitsparameter, auf den prozentualen Anteil vitaler Spermien und auf Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential im Vergleich zum Standardeinfrierverfahren nach 2,5 Std. (p<0,05). In Versuchsreihe III wurde der Einfluss einer langsamen Abkühlungsrate auf 5°C vor dem Einfrierprozess mit direktem Einfrieren nach Zentrifugieren und der Glyzerinzugabe bei 22°C auf die Qualität von Tiefgefriersperma verglichen. Dies wurde anhand von 8 Hengsten (3 Ejakulate pro Hengst) überprüft, die aufgrund ihrer Spermaqualität nach 24 Std. Lagerung bei 5°C in zwei Gruppen mit guter (n=4) und schlechter (n=4) Toleranz gegenüber dem Abkühlungsprozess und der Lagerung bei 5°C aufgeteilt worden waren. Nach langsamer Abkühlungsrate über eine Dauer von 2,5 Std. vor dem Einfrieren zeigte sich eine signifikante Überlegenheit bei der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien, bei dem prozentualen Anteil membranintakter und somit vitaler Spermien und bei den prozentualen Anteil der Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential gegenüber dem direkten Einfrierverfahren von 22°C (p≤0,05). Beim akrosomalen Status wies die direkte Einfriermethode ohne Abkühlungszeit auf 5°C einen signifikant höheren Anteil akrosomreagierter Samenzellen auf als nach einer langsamen Abkühlungszeit (p≤0,05). In Versuchsreihe IV wurde der Einfluss von drei verschiedenen Samenzellkonzentrationen in 0,5 ml-Pailletten auf die Tiefgefriersamenqualität von 8 Hengsten, aufgeteilt in Gruppen mit guter und schlechter Tiefgefriereignung (n=4, 3 Ejakulate pro Hengst), untersucht. Die aufgetauten Samenproben zeigten bei einer Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml und 800x106 Samenzellen/ml signifikant höhere Werte für die Vorwärtsbeweglichkeit, die Geschwindigkeitsparameter sowie für den prozentualen Anteil membranintakter und somit vitaler Spermien als bei einer Konzentration von 1,6x109Samenzellen/ml. Während eine Erhöhung der Konzentration auf 800x106 Samenzellen/ml bei Hengsten mit guter Tiefgefriereignung (n=4) keinen Einfluss auf die Samenqualität zeigte, erwies sich bei Hengsten mit schlechter Tiefgefriereignung (n=4) eine Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml von Vorteil. Ein nach diesen Ergebnissen vorzuschlagendes Aufbereitungsprotokoll zur Kryokonservierung von Hengstsamen beinhaltet die Zentrifugation mit Hilfe der Kissenzentrifugationstechnik für 20min bei 1000 x g, kombiniert mit einem Magermilch oder Eigelb enthaltenden Zentrifugationsverdünner, der Zugabe von Glyzerin bei 22°C nach der Zentrifugation und einer langsamen Abkühlungsrate auf 5°C über einen Zeitraum von 2,5 Std. sowie eine Konfektionierung mit einer Konzentration von 200x106 Samenzellen/ml in 0,5 ml-Pailletten.