Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression and characterization of protocadherin LKC in mammalian cells

Krahn, Michael Peter Rolf

The modulation of cell-cell contacts and thereby the mediation of intracellular signalling pathways is an inevitable event in the functional establishment and morphological formation of various tissues, especially in epithelia. It has been already demonstrated in several diseases that an aberrant expression of cell adhesion molecules can cause severe modifications of physiological cell functions, including organ dysfunction and carcinogenesis. In the presented work, the cell adhesion protein protocadherin LKC (PLKC) was analyzed in respect of its expression in epithelial cells and subcellular distribution as well as transport characteristic and functional properties. It has been already shown previously that a re-expression in a PLKC-deficient colon-carcinoma cell line results in reconstitution of polar epithelial morphology (Okazaki et al., 2003). Therefore possible implications in growth arrest and cell cycle regulation were elucidated. First, the expression of PLKC mRNA in different epithelial cell was assayed by use of semiquantitative PCR. In all cell lines tested, a significant increase of mRNA concentration during distinct phases of cell differentiation was observed. This is in line with the finding that PLKC is redistributed at the apical membrane and at sites of lateral cell-cell contacts when cells get in first contact with each other. In order to analyze the subcellular localization and biochemical characteristics, the cDNA encoding PLKC was cloned into the eukaryotic expression vector pEYFP-N1. Thereby it was possible to visualize the protein in a cell culture system by means of high resolution confocal laser microscopy. In a completely differentiated monolayer of kidney epithelial cells (MDCK-II), which were stably transfected with PLKC-YFP, the protein was predominately localized at the apical and lateral membrane. Quantification by use of a cell surface biotinylation revealed an apical sorting fidelity of over 95 %. At the lateral domain, PLKC colocalizes neither with E-cadherin, a marker for adherens junctions, nor with ZO-1 or occludin both represented in complexes of the tight junctions. In contrast, a significant colocalization with actin filaments at the apical membrane and in the lateral cell contact sites was detected. However, a strong connection to the actin cytoskeleton as it is described for several cadherins does not take place. The performed biochemical analyses showed that PLKC is transported rather quickly to the cell surface and that it’s trafficking as well as the anchoring in the cell membrane is mediated by detergent resistant lipid microdomains (so called “rafts”). A block of discrete glycosylation events as well as the stable expression of PLKC in glycosylation-deficient cells demonstrated that the correct protein targeting is neither dependent on O- nor on N-glycosylation. Furthermore, functional properties of PLKC were investigated in a fibroblast-model (Chinese Hamster Ovarian cell, CHO). Therefore, a new cell line (CHO-PLKC-YFP), stably expressing PLKC-YFP was established and cell aggregation activity, proliferation rate and growth characteristics were compared with cells which have been transfected with an empty vector. The results prove that PLKC exhibits a significant calcium dependent adhesion activity which is not mediated by the actin cytoskeleton. Surprisingly, this activity is nearly as strong as the one measured for E-cadherin and stronger than in case of N-cadherin in the same model. The fact that PLKC was found to be expressed on the cell surface as a homophilic dimer led to the speculation that cell-adhesion is mediated by dimerization as it is described for other cadherins, integrins or immunoglobuline receptors. However, a trans-cellular dimeric form, tethering two neighbouring cells together, was not detectable by the applied technique. Moreover, the analyzed protocadherin is capable to change growth characteristics and morphology of confluent CHO cells. CHO cells transfected with an empty vector showed a typical oval or longish cell shape and a “fish-swarm-like” morphology, whereas confluent CHO cell stably expressing PLKC-YFP exhibited rather a round, square or rhomboid cell shape which resembles the growth morphology of an epithelial monolayer. In this cell culture, PLKC was predominately localized at sites of cell-cell contacts. Evaluations of the cell proliferation compared to mock-transfected cell showed no significant influence on growth characteristics. However, the stable transfection of PLKC in MDCK cells resulted in a significant increase in the transepithelial electrical resistance, indicating that PLKC exhibits strong cell-cell adhesion activities either by direct sealing the intercellular space or by induction of tighter formation of the zonula occludens. Finally the function of PLKC was explored in MDCK-II cells by downregulation of endogenous PLKC. 72 hours after injection of a PLKC-specific siRNA, the treated cells exhibited an altered, polymorphic cell shape and the cell borders to neighbouring cells became fuzzy, hinting at a tendency for cell expansion. By use two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis, several potential adaptor proteins have been identified which are probably bound by the cytoplasmic tail and which may contribute to an intracellular signaling of PLKC. In order to gain insights in structural feature of PLKC, different deletion mutants were constructed and thereby the role of the discrete extracellular cadherin domains, the transmembrane region, the intracellular PDZ-binding motif or the whole cytosolic tail was determined. The results indicate that a deletion of the membrane spanning region abolishes the association with lipid microdomains and creates a secretory variant of the protein. Nevertheless, the apical sorting efficiency is maintained and the anchorless protein is nearly exclusively secreted into the apical cell supernatant. A lack of the cytosolic fragment results in a random transport to either the apical or the basal cell surface. Furthermore, a distinct amount of protein is blocked intracellular in the golgi apparatus and the lateral cell-cell contact sites are devoid of the mutated PLKC. This led to the conclusion that the apical as well as the lateral sorting is mediated by the cytosolic tail whereas a basic transport competence is at least in part still maintained, when the cytoplasmic region is deleted. Among the extracellular domains which are arranged in seven so called “cadherin repeats”, the first motif, located at the amino-terminal end, seems to be essential for correct processing of PLKC because a deletion of this domain resulted in a total block of the protein in the endoplasmic reticulum. An excision of the sixth cadherin repeat decreased significantly the intracellular trafficking but the subcellular distribution is not affected. All other cadherin motif deletion mutants and the truncation of the C-terminal PDZ-binding motif did not show any effect on protein transport or intracellular localization.

Vermittlung von Zell-Zell Kontakten und damit verbundenen intrazellulären Signalkaskaden ist ein essentielles Ereignis in der funktionellen und morphologischen Etablierung von verschiedenen und insbesondere von epithelialen Geweben. Vielfach konnte bereits gezeigt werden, dass eine veränderte Expression von Zell-Zell Adhäsionsmolekülen zu ernsten Störungen der Zellphysiologie führen, deren Auswirkungen von einzelnen Organdefekten bis hin zur Krebsentstehung reichen. In der vorgelegten Arbeit wurden für das Zell-Adhäsionsmolekül Protocadherin LKC (PLKC) die Expression in epithelialen Zellen, intrazelluläre Lokalisation, sowie das Transportverhalten und funktionelle Eigenschaften untersucht. Da bereits in einer früheren Studie gezeigt werden konnte, dass eine Re-Expression in einer PLKC-defizienten Colon-Carcinoma Zelllinie mit der Wiederherstellung der polaren Wachstumsmorphologie verbunden ist (Okazaki et al., 2003), wurde das Protocadherin vor allem auch in Hinblick auf seine möglichen Implikationen in Wachstumsprozessen und morphologischer Regulation genauer analysiert. Dazu wurde zunächst die mRNA Expression in verschieden epithelialen Zelllinien, mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Hier wurde für alle bearbeiteten Zelltypen eine signifikante Steigerung der mRNA Konzentration im zeitlichen Verlauf der Ausdifferenzierung der Zellen nachgewiesen. Dies korreliert mit einer Umverteilung des Proteins zur apikalen Membran und in die Regionen der Zell-Zell-Interaktion an der lateralen Membran. Zur Untersuchung der intrazellulären Verteilung und seiner biochemischen Eigenschaften wurde die cDNA des PLKC in einen Reportergenvektor kloniert (pEYFP-N1), wodurch das Protein mittels hochauflösender konfokaler Laser-mikroskopie im Zellkulturmodell visualisiert werden konnte. In voll ausdifferenzierten Monolayern von Nierenepithelzellen (MDCK-II), die stabil mit PLKC-YFP transfiziert wurden, wurde das Protein hauptsächlich an der apikalen und lateralen Membran gefunden. Die Quantifizierung der Proteinverteilung über eine Oberflächenbiotinylierung ergab eine über 95 %ige Sortiergenauigkeit zur apikalen Membran. An der lateralen Membran colokalisiert PLKC jedoch weder mit E-cadherin, einem bekanntem Marker für die Adherens junctions, noch mit Occludin oder ZO-1, beides Proteine der zonula occludens. Dagegen wurde eine deutliche Kolokalisierung mit Aktinfibrillen an lateralen Zellkontakten und an der apikalen Membran gefunden, allerdings findet eine stärkere Bindung des Aktinzytoskelettes, wie sie von anderen Cadherinen beschrieben ist, nicht statt. Die durchgeführten biochemischen Analysen zeigten, dass PLKC sehr schnell zur Zelloberfläche transportiert wird und dass sowohl dieser Transport als auch die Verankerung in der Zellmembran durch detergensresistente Lipidmikrodomänen (so genannte „rafts“) vermittelt werden. Nachfolgend wurde durch die gezielte Blockierung einzelner Glykosylierungsschritte sowie durch eine stabile Expression des Proteins in glykosylierungsdefizienten Zelllinien bewiesen, dass der gerichtete Transport wie auch die Assoziierung mit „rafts“ weder von der O- noch von der N-Glykosylierung abhängt. Des Weiteren wurden funktionelle Aspekte des Protocadherin LKC in einem Fibroblastenmodell (Chinese Ovarian Hamster Zellen, CHO) getestet. Hierzu wurde eine neue Zelllinie (CHO-PLKC-YFP) etabliert, die das Protein stabil exprimiert und Zell-aggregationseigenschaften, Proliferationsrate und Wachstumsmorphologie mit untransfizierten bzw. mit einem leeren Vektor transfizierten Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass PLKC eine deutliche, Kalzium-abhängige Zell-Adhäsions-Aktivität aufweist, die jedoch nicht vom Aktinzytoskelett vermittelt wird und erstaunlicherweise nur unwesentlich niedriger ist als die des E-Cadherins und die des N-Cadherin (beide als Marker eingesetzt) sogar übertrifft. Da darüber hinaus eine Dimerisierung des Protocadherin PLKC nachgewiesen wurde, liegt die Vermutung nahe, dass, ähnlich wie bei klassischen Cadherinen, Integrinen oder Immunoglobulin-Rezeptoren, mögliche Zell-Zell Interaktionen über dimere Formen vermittelt werden – allerdings konnte eine transzelluläre Dimerisierung zwischen zwei benachbarten Zellen mit der verwendeten Methodik nicht nachgewiesen werden. Das untersuchte Protocadherin ist weiterhin in der Lage, die Zellmorphologie konfluenter CHO-Zellen zu ändern. Während die mit einem leerem YFP-Vektor transfizierten Fibroblasten eine typische, längliche Form und eine „fischschwarmförmige“ Wachstumsmorphologie zeigen, nehmen Zellen, die stabil PLKC exprimieren, eher eine runde oder rhombische bis sechseckige Gestalt an und weisen nach Erreichen einer gewissen Dichte eine epithelähnliche Wachstumsmorphologie auf. In diesen Zellen ist das Protein deutlich in den Zell-Zell Interaktionszonen lokalisiert. Untersuchungen zur Proliferationsgeschwindigkeit zeigten jedoch, dass es zu keiner Beeinflussung der Teilungsrate der Zellen im Vergleich zum Wildtyp kommt. In epithelialen Zellen konnte nachgewiesen werden dass eine Überexpression von Protocadherin LKC einen deutlich gesteigerten Widerstand des Zellverbandes induziert, was auf ein hohes Potential des Proteins in Zell-Zell-Adhäsionsprozessen hindeutet. Schließlich wurde die Funktion des PLKC durch Herabregulierung des endogenen PLKC-Levels in MDCK-II Zellen analysiert. Hier erscheinen 72 Stunden nach Injektion von PLKC-spezifischer anti-sense RNA die behandelten Zellen polymorph, die Zellgrenzen zu benachbarten Zellen werden undeutlich und die Zellen scheinen zu expandieren. Mit Hilfe einer zweidimensionalen Gelelektrophorese war es ferner möglich, mehrere potentielle neue Bindungspartner zu identifizieren, die an die cytoplasmatischen Domäne des Protocadherin LKC binden und eventuell mögliche intrazelluläre Signalübertragungswege vermitteln können. Um Aufschluss über strukturelle Charakteristika des Proteins zu gewinnen wurden verschiedene Deletionsmutanten erstellt und somit die Rolle der einzelnen extrazellulären Domänen, der Transmembran-Domäne sowie einer intrazellulären PDZ-Bindungssequenz bzw. der gesamten zytosolischen Domäne untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass durch die Deletion der Transmembran-Domäne zwar die Assoziation mit „rafts“ aufgehoben wird und eine sekretorische Variante kreiert wird, aber eine eindeutig apikale Sortierung beibehalten wird. Ein fehlendes zytosolisches Fragment des Proteins resultiert in einem willkürlichen Transport sowohl zur apikalen als auch zur basalen Seite und einem partiellen intrazellulären Block im Golgi-Apparat. Interessanterweise wird diese Mutante nicht mehr in die Zell-Zell Interaktionsräume transportiert, was darauf hindeutet, dass sowohl der gezielte laterale Transport, als auch die gerichtete Sortierung zur apikalen Membran durch die zytoplasmatische Domäne beeinflusst wird, während die grundlegende Transport-Kompetenz noch eingeschränkt erhalten bleibt. Unter den extrazellulären Domänen, die sich in sieben so genannte „cadherin repeats“ gliedern, hat das erste, am N-Terminus gelegene Repeat anscheinend eine grundlegende Bedeutung für die Prozessierung des Proteins, da seine Deletion in einem vollständigen Transportblock im Endoplasmatischen Retikulum resultiert. Eine Ausschaltung der sechsten Domäne verlangsamt den Transport des Proteins sehr stark, die intrazelluläre Verteilung wird jedoch nicht beeinflusst. Alle anderen Cadherin-Repeats, wie auch die cytoplasmatische PDZ-Bindungssequenz scheinen keinen Einfluss auf die die Prozessierung des Protocadherins zu haben.


Citation style:

Krahn, Michael Peter Rolf: Expression and characterization of protocadherin LKC in mammalian cells. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.


Use and reproduction:
All rights reserved