Expression and characterization of protocadherin LKC in mammalian cells

Vermittlung von Zell-Zell Kontakten und damit verbundenen intrazellulären Signalkaskaden ist ein essentielles Ereignis in der funktionellen und morphologischen Etablierung von verschiedenen und insbesondere von epithelialen Geweben. Vielfach konnte bereits gezeigt werden, dass eine veränderte Expression von Zell-Zell Adhäsionsmolekülen zu ernsten Störungen der Zellphysiologie führen, deren Auswirkungen von einzelnen Organdefekten bis hin zur Krebsentstehung reichen. In der vorgelegten Arbeit wurden für das Zell-Adhäsionsmolekül Protocadherin LKC (PLKC) die Expression in epithelialen Zellen, intrazelluläre Lokalisation, sowie das Transportverhalten und funktionelle Eigenschaften untersucht. Da bereits in einer früheren Studie gezeigt werden konnte, dass eine Re-Expression in einer PLKC-defizienten Colon-Carcinoma Zelllinie mit der Wiederherstellung der polaren Wachstumsmorphologie verbunden ist (Okazaki et al., 2003), wurde das Protocadherin vor allem auch in Hinblick auf seine möglichen Implikationen in Wachstumsprozessen und morphologischer Regulation genauer analysiert. Dazu wurde zunächst die mRNA Expression in verschieden epithelialen Zelllinien, mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Hier wurde für alle bearbeiteten Zelltypen eine signifikante Steigerung der mRNA Konzentration im zeitlichen Verlauf der Ausdifferenzierung der Zellen nachgewiesen. Dies korreliert mit einer Umverteilung des Proteins zur apikalen Membran und in die Regionen der Zell-Zell-Interaktion an der lateralen Membran. Zur Untersuchung der intrazellulären Verteilung und seiner biochemischen Eigenschaften wurde die cDNA des PLKC in einen Reportergenvektor kloniert (pEYFP-N1), wodurch das Protein mittels hochauflösender konfokaler Laser-mikroskopie im Zellkulturmodell visualisiert werden konnte. In voll ausdifferenzierten Monolayern von Nierenepithelzellen (MDCK-II), die stabil mit PLKC-YFP transfiziert wurden, wurde das Protein hauptsächlich an der apikalen und lateralen Membran gefunden. Die Quantifizierung der Proteinverteilung über eine Oberflächenbiotinylierung ergab eine über 95 %ige Sortiergenauigkeit zur apikalen Membran. An der lateralen Membran colokalisiert PLKC jedoch weder mit E-cadherin, einem bekanntem Marker für die Adherens junctions, noch mit Occludin oder ZO-1, beides Proteine der zonula occludens. Dagegen wurde eine deutliche Kolokalisierung mit Aktinfibrillen an lateralen Zellkontakten und an der apikalen Membran gefunden, allerdings findet eine stärkere Bindung des Aktinzytoskelettes, wie sie von anderen Cadherinen beschrieben ist, nicht statt. Die durchgeführten biochemischen Analysen zeigten, dass PLKC sehr schnell zur Zelloberfläche transportiert wird und dass sowohl dieser Transport als auch die Verankerung in der Zellmembran durch detergensresistente Lipidmikrodomänen (so genannte „rafts“) vermittelt werden. Nachfolgend wurde durch die gezielte Blockierung einzelner Glykosylierungsschritte sowie durch eine stabile Expression des Proteins in glykosylierungsdefizienten Zelllinien bewiesen, dass der gerichtete Transport wie auch die Assoziierung mit „rafts“ weder von der O- noch von der N-Glykosylierung abhängt. Des Weiteren wurden funktionelle Aspekte des Protocadherin LKC in einem Fibroblastenmodell (Chinese Ovarian Hamster Zellen, CHO) getestet. Hierzu wurde eine neue Zelllinie (CHO-PLKC-YFP) etabliert, die das Protein stabil exprimiert und Zell-aggregationseigenschaften, Proliferationsrate und Wachstumsmorphologie mit untransfizierten bzw. mit einem leeren Vektor transfizierten Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass PLKC eine deutliche, Kalzium-abhängige Zell-Adhäsions-Aktivität aufweist, die jedoch nicht vom Aktinzytoskelett vermittelt wird und erstaunlicherweise nur unwesentlich niedriger ist als die des E-Cadherins und die des N-Cadherin (beide als Marker eingesetzt) sogar übertrifft. Da darüber hinaus eine Dimerisierung des Protocadherin PLKC nachgewiesen wurde, liegt die Vermutung nahe, dass, ähnlich wie bei klassischen Cadherinen, Integrinen oder Immunoglobulin-Rezeptoren, mögliche Zell-Zell Interaktionen über dimere Formen vermittelt werden – allerdings konnte eine transzelluläre Dimerisierung zwischen zwei benachbarten Zellen mit der verwendeten Methodik nicht nachgewiesen werden. Das untersuchte Protocadherin ist weiterhin in der Lage, die Zellmorphologie konfluenter CHO-Zellen zu ändern. Während die mit einem leerem YFP-Vektor transfizierten Fibroblasten eine typische, längliche Form und eine „fischschwarmförmige“ Wachstumsmorphologie zeigen, nehmen Zellen, die stabil PLKC exprimieren, eher eine runde oder rhombische bis sechseckige Gestalt an und weisen nach Erreichen einer gewissen Dichte eine epithelähnliche Wachstumsmorphologie auf. In diesen Zellen ist das Protein deutlich in den Zell-Zell Interaktionszonen lokalisiert. Untersuchungen zur Proliferationsgeschwindigkeit zeigten jedoch, dass es zu keiner Beeinflussung der Teilungsrate der Zellen im Vergleich zum Wildtyp kommt. In epithelialen Zellen konnte nachgewiesen werden dass eine Überexpression von Protocadherin LKC einen deutlich gesteigerten Widerstand des Zellverbandes induziert, was auf ein hohes Potential des Proteins in Zell-Zell-Adhäsionsprozessen hindeutet. Schließlich wurde die Funktion des PLKC durch Herabregulierung des endogenen PLKC-Levels in MDCK-II Zellen analysiert. Hier erscheinen 72 Stunden nach Injektion von PLKC-spezifischer anti-sense RNA die behandelten Zellen polymorph, die Zellgrenzen zu benachbarten Zellen werden undeutlich und die Zellen scheinen zu expandieren. Mit Hilfe einer zweidimensionalen Gelelektrophorese war es ferner möglich, mehrere potentielle neue Bindungspartner zu identifizieren, die an die cytoplasmatischen Domäne des Protocadherin LKC binden und eventuell mögliche intrazelluläre Signalübertragungswege vermitteln können. Um Aufschluss über strukturelle Charakteristika des Proteins zu gewinnen wurden verschiedene Deletionsmutanten erstellt und somit die Rolle der einzelnen extrazellulären Domänen, der Transmembran-Domäne sowie einer intrazellulären PDZ-Bindungssequenz bzw. der gesamten zytosolischen Domäne untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass durch die Deletion der Transmembran-Domäne zwar die Assoziation mit „rafts“ aufgehoben wird und eine sekretorische Variante kreiert wird, aber eine eindeutig apikale Sortierung beibehalten wird. Ein fehlendes zytosolisches Fragment des Proteins resultiert in einem willkürlichen Transport sowohl zur apikalen als auch zur basalen Seite und einem partiellen intrazellulären Block im Golgi-Apparat. Interessanterweise wird diese Mutante nicht mehr in die Zell-Zell Interaktionsräume transportiert, was darauf hindeutet, dass sowohl der gezielte laterale Transport, als auch die gerichtete Sortierung zur apikalen Membran durch die zytoplasmatische Domäne beeinflusst wird, während die grundlegende Transport-Kompetenz noch eingeschränkt erhalten bleibt. Unter den extrazellulären Domänen, die sich in sieben so genannte „cadherin repeats“ gliedern, hat das erste, am N-Terminus gelegene Repeat anscheinend eine grundlegende Bedeutung für die Prozessierung des Proteins, da seine Deletion in einem vollständigen Transportblock im Endoplasmatischen Retikulum resultiert. Eine Ausschaltung der sechsten Domäne verlangsamt den Transport des Proteins sehr stark, die intrazelluläre Verteilung wird jedoch nicht beeinflusst. Alle anderen Cadherin-Repeats, wie auch die cytoplasmatische PDZ-Bindungssequenz scheinen keinen Einfluss auf die die Prozessierung des Protocadherins zu haben.